8.2 Опыление in vitro для преодоления межвидовой несовместимости

Опыление in vitro используют, прежде всего, для преодоления презиготной несовместимости при межвидовых и внутривидовых скрещиваниях. Впервые этот метод был успешно применен индийскими учеными [Kanta et al., 1962] для получения самоопыленного потомства у самонесовместимого мака Papaver somniferum. Позднее с его помощью были получены самоопыленные линии различных самонесовместимых видов, а также гибриды между разными видами капусты, табака, петунии и другими представителями разных систематических групп (см. Zenkteler, 1992; Bhojwani, Razdan, 1996).

Метод включает: обнажение семяпочки или семяпочек путем удаления тканей пестика и завязи, нанесение на них пыльцы и культивирование оплодотворенных семяпочек на питательной среде до образования зрелых семян. Культивирование завязей или семяпочек , как правило, производят на сравнительно простой питательной среде Нича [Nitsch, 1951] с 5 % сахарозы. Во многих случаях благоприятное влияние на развитие семян оказывало добавление в среду различных регуляторов роста (ауксинов, цитокининов), а также кокосового молока, дрожжевого экстракта, различных аминокислот.

Было предложено несколько вариантов метода: опыление и культивирование изолированных завязей, семяпочек, прикрепленных к плаценте, семяпочек без плаценты. Подобно оплодворению в пробирке у животных, удалось добиться выделения и слияния in vitro единичных женских и мужских гамет и регенерации из продуктов слияния растений [Kranz, Lorz, 1993]. Был разработан метод химического слияния гамет (с помощью CaCl₂), который обеспечивал высокую частоту (около 80%) слияния преимущественно женских гамет с мужскими [Faure et al. 1994]. При этом отсутствовала полиспермия (оплодотворение яйцеклеток несколькими спермиями), что делает излишним применение обязательных при соматической гибридизации селективных систем для отбора продуктов слияния (см. ниже).

Культура оплодотворенных завязей оказалась весьма эффективным приемом также для получения межвидовых и даже межродовых гибридов в комбинациях, которые ранее не удавались из-за постгамной несовместимости (гибели зародыша на ранних стадиях развития из-за несовместимости с эндоспермом, раннего опадания плодов). С помощью этого метода были получены ценные для селекции межвидовые гибриды хлопчатника, клевера, подсолнечника.

Используя в межвидовой гибридизации методы опыления in vitro или культуры оплодотворенных завязей, не всегда удается получить зрелые выполненные семена, содержащие жизнеспособные зародыши. Однако эти технологии дают возможность предотвратить преждевременную гибель гибридных зародышей и «дорастить» их до размеров и стадии, когда их можно извлечь из культивируемых семяпочек и поместить на питательную среду для получения растений-регенерантов. Метод эмбриокультуры имеет и самостоятельное значение для устранения последствий постгамной межвидовой несовместимости.

8.3 Применение эмбриокультуры для устранения последствий постгамной межвидовой несовместимости

Первым продемонстрировал возможности использования культуры изолированных зародышей для целей преодоления межвидовых репродуктивных барьеров Laibach (1925, 1929). С помощью этого метода ему удалось получить межвидовые гибриды Linum perenne × L. austriacum из щуплых невсхожих семян. В настоящее время этот метод широко используется в селекции для целей межвидовой гибридизации риса, фасоли, томатов, картофеля, лилий, донника и других культур. Этот метод используют также при получении гаплоидов путем опыления пыльцой гаплопродюсеров, облученной пыльцой (см. 7.8), для прерывания периода покоя семян и других целей.

Методика культуры in vitro зиготических зародышей (ее в англоязычной литературе называют «embryo rescue» - спасение зародышей) относительно простая. Зародыши вычленяют в стерильных условиях из гибридных семян, помещают их на питательную среду и при культивировании на свету добиваются регенерации из них растений. В качестве питательных сред используют обычные для культуры клеток среды Мурасиге и Скуга, В-5 Гамборга и другие. Концентрация сахарозы для относительно зрелых зародышей 2-3%, для незрелых она может быть выше (до 10%). Как правило, используют среды без добавления регуляторов роста. Однако в отдельных случаях их добавление является необходимым. Повысить эффективность эмбриокультуры можно также с помощью добавления в среду различных биологических жидкостей: дрожжевого экстракта, гидролизата казеина, кокосового молока, растительных экстрактов, а также аминокислот и витаминов.

Эффективность регенерации растений в культуре зародышей в значительной степени зависит от размера эксплантата и стадии развития зародыша: чем больше эксплантат и чем более зрелый зародыш, тем выше вероятность регенерировать из него растение. Однако при межвидовых скрещиваниях гибридные зародыши нередко погибают на самых ранних стадиях развития из-за несовместимости с эндоспермом или из-за недоразвитого эндосперма, преждевременного опадания ягод. Для того чтобы предотвратить или отсрочить эти неблагоприятные явления применяют такие методические приемы, как обработку завязавшихся ягод регуляторами роста (ауксинами), культуру оплодотворенных завязей (см. 8.2). Для культуры мелких зародышей на ранних стадиях развития используют обогащенные питательные среды, а также получают из них каллюс, из которого затем регенерируют растения [Thomas, Pratt, 1981]. Следует заметить, что регенерационная способность у каллюсных культур злаковых, полученных из незрелых зиготических зародышей значительно выше, чем у культур, полученных из зрелых зародышей.