8.4 Получение межвидовых гибридов путем слияния протопластов для интрогрессии ценных генов в селекционный материал

Описанные выше в этой главе методы культуры клеток и тканей позволяют повысить эффективность получения гибридов между филогенетически отдаленными видами растений путем половых скрещиваний. Однако во многих случаях и их применение не обеспечивает преодоление существующих межвидовых репродуктивных барьеров. Использование методов соматической гибридизации путем слияния протопластов открывает новые возможности в этой области.

Первая методика слияния протопластов, основанная на применении нитрата натрия, была разработана в лаборатории Э. Кокинга в Ноттингемском университете [Power et al., 1970, Evans, Cocking, 1975]. С помощью этой методики в США в 1972 г были получены первые растения соматических гибридов между разными видами табака (Nicotiana glauca+N. langsdorffii) [Carlson et al. 1972]. В настоящее время технология соматической гибридизации отработана для многих хозяйственно важных видов растений. Получено большое количество ценных соматических гибридов, на основе которых выведены новые сорта.

Технология соматической гибридизации включает следующие этапы: получение суспензий протопластов двух видов растений, гибриды между которыми предполагается получить, получение смешанной суспензии протопластов двух видов и использование экспериментальных воздействий (химических или электрических), обеспечивающих слияние протопластов, отбор продуктов слияния, получение из них каллюсной культуры и регенерация растений соматических гибридов, подтверждение их гибридности.

8.4.1 Методы слияния протопластов

Изолированные протопласты, как правило, являются одноименно (отрицательно) заряженными частицами. Поэтому для того, чтобы они сблизились и произошло слияние протопластов разных видов, в питательную среду к суспензии протопластов добавляют определенные вещества («фьюзогены» от англ. fusion - слияние) или суспензию подвергают воздействию электрическим током.

Как отмечалось выше, в качестве первого «фьюзогена» использовали NaNO₃ [Power et al., 1970]. Позднее были предложены менее токсичные и более эффективные воздействия. Наибольшее распространение получили следующие системы слияния протопластов: высокая концентрация в среде ионов Ca²⁺ (около 50 мМ) и высокая рН (9-11) при 37^оС [Keller, Melchers, 1973]; добавка в среду полиэтиленгликоля (ПЭГ) [Kao, Michayluk, 1974; Wallin et al. 1974]; сочетание ПЭГ + высокая концентрация ионов Ca²⁺ и высокая рН. Полиэтиленгликоль используют молекулярной массой 1500-6000 в концентрации 15-45%, продолжительность воздействия 15-20 мин. Его применение обеспечивает высокую частоту слияния протопластов (выше 30%) большого числа видов растений.

Предполагается, что длинная молекула ПЭГ может создавать молекулярный мостик между поверхностями соседних протопластов, вызывая их адгезию (слипание), которая усиливается в присутствии ионов Ca²⁺ благодаря нейтрализации отрицательного заряда мембран протопластов. Слияние протопластов происходит во время последующей отмывки суспензии от фьюзогенов, вызывающей осмотический шок и перераспределение электрических зарядов на большой поверхности тесно контактирующих мембран протопластов. Первоначально между контактирующими протопластами в местах разрыва мембран формируются небольшие цитоплазматические мостики. Постепенно они расширяются и, наконец, образуются гибридные протопласты (гетерокариоциты) сферической формы. Перемешивание цитоплазм в них завершается в течение 3-10 час. В процессе деления гетерокариоцитов (в профазе-метафазе митоза) происходит объединение генетического материала ядер, в результате первого митоза образуется два гибридных ядра.

Метод электрослияния протопластов растений впервые был предложен Zimmermann, Scheurich (1981). На основе этой разработки в США было начато производство автоматической установки «Zimmermann Electrofusion System», которая, а также аналогичные приборы, показали высокую эффективность для получения разнообразных соматических гибридов. Электрослияние осуществляют в специальной кювете прибора с двумя электродами, расстояние между ними 0,2 мм. Через питательную среду, в которую помещают суспензию протопластов двух видов, пропускают высоковольтные импульсы (синусоидальная волна; расстояние между пиками 5-10 В; частота 500 кгц; напряжение от 200 В до 350 В, длительность импульса ~50 мс;). Параметры электрического поля и продолжительность его действия в каждом случае подбирают экспериментально. Под действием тока на электродах образуются агрегаты из 2-3 протопластов, либо цепочки из 5÷6 протопластов между электродами. В это время на электроды подают единичные импульсы постоянного тока, которые приводят к образованию пор в сильно сжатых мембранах протопластов. В результате происходит перемешивание цитоплазмы контактирующих протопластов и образуются гибридные протопласты. В основе слияния лежит различное действие постоянного и переменного электрического тока на плазмалемму: постоянное эклектическое поле сжимает мембраны, ведя к их локальному разрушению, а переменное – вызывает латеральную диффузию белков мембраны, образуя свободные от гликопротеидов липидные области, где противоположные мембраны могут установить контакт.

Считается, что метод электрослияния протопластов более эффективный, чем химический. Он обеспечивает высокую частоту слияния - 10-50% (при химическом – 10-30%). Продолжительность процедуры составляет всего около 15 минут, протопласты не подвергаются воздействию токсических веществ, что положительно сказывается на жизнеспособности гетерокариоцитов. Однако следует иметь в виду, что приборы для электрослияния протопластов весьма дорогостоящи. Практика показывает, что, как правило, по эффективности оба метода равноценны.