Глава 8 Использование методов культуры клеток и тканей растений in vitro для преодоления межвидовых репродуктивных барьеров

Селекция любой культуры может быть эффективной лишь в случае достаточно высокой генетической изменчивости исходного селекционного материала. Для многих сельскохозяйственных растений характерна весьма узкая генетическая основа, что существенно затрудняет выведение новых сортов. Наиболее эффективным методом расширения генетической базы селекционного материала является гибридизация его с дикими и примитивными культурными родственными видами (отдаленная гибридизация). В селекции нашло отражение два основных направления использования отдаленной гибридизации: с целью расширения генетической базы соответствующего культурного вида (расширения аллельного разнообразия) и для интрогрессии в селекционный материал отдельных ценных генов.

Для реализации первого из названных направлений наибольший интерес представляют виды, выращиваемые местным населением в центрах происхождения культуры (примитивные культурные виды). Как правило, они относительно легко скрещиваются с культурным видом. Полученные гибриды скрещивают между собой или беккроссируют культурным видом, получая селекционный материал с расширенным аллельным разнообразием, использование которого позволяет повысить эффективность селекции культуры на продуктивность и экологическую стабильность.

Для интрогрессии в селекционный материал отдельных генов от диких видов получают межвидовые гибриды с участием культурного вида, затем проводят ряд беккроссов культурным видом с тем, чтобы в селекционном материале осталась лишь незначительная часть привнесенного генетического материала от дикого сородича, связанная с экспрессией каких-либо ценных генов, отсутствующих у культурного вида, например, генов устойчивости к абиотическим и биотическим факторам окружающей среды, признаков качества продукции.

Многие культурные виды имеют большое количество диких сородичей, представляющих интерес для селекции. Некоторые из них можно непосредственно скрестить с культурными формами. Однако во многих случаях такие скрещивания связаны со значительными проблемами, вызванными естественными межвидовыми барьерами. Выделяют следующие основные факторы, обеспечивающие обособление видов: 1) внешние экологические барьеры: физическое разделение популяций видов в пространстве и времени (несовпадение периода цветения), обусловленное их адаптацией к специфическим экологическим нишам; 2) геномные различия между видами; 3) различия в плоидности; 4) внутренние барьеры, препятствующие гибридизации (пре- и постзиготные репродуктивные барьеры).

Первые из названных барьеров преодолеть относительно легко, добившись одновременного цветения скрещиваемых видов в одном месте. Значительные геномные различия между видами делают практически невозможной интрогрессию ценных генов от одного вида к другому из-за нарушений рекомбинации генов в мейозе межвидовых гибридов. Относительно просто можно совместить в одном генотипе ценные признаки от двух видов со значительными геномными различиями, получив амфидиплоидные межвидовые гибриды [Карпеченко, 1935]. У таких гибридов геномы родительских видов представлены в диплоидной форме, благодаря чему возможна нормальная конъюгация в мейозе гомологичных хромосом. Однако этот метод применим преимущественно к гибридам между культурными видами (пример – тритикале, гибрид между пшеницей и рожью).

Различия в плоидности между скрещиваемыми видами могут быть причиной нескрещиваемости между ними (см. ниже постзиготные репродуктивные барьеры) или стерильности межвидовых гибридов даже в случае наличия у родительских видов сходных геномов. Во многих случаях эту проблему нетрудно решить, увеличив или уменьшив плоидность одного из видов (пример – получение гибридов между автотетраплоидным культурным картофелем и диплоидными дикими или примитивными культурными видами картофеля: см. 7.12).

Особую проблему представляют репродуктивные межвидовые барьеры, связанные с пре- или постзиготной (постгамной) несовместимостью. Для их преодоления разработаны специальные приемы, основанные, в том числе, на применении методов культуры клеток и протопластов in vitro.

8.1 Пре- и постзиготная (постгамная) межвидовая несовместимость

Презиготные барьеры могут проявляться в виде непрорастания пыльцы на рыльце пестика, прорастания, но не сопровождающегося проникновением пыльцевой трубки в ткани пестика, проникновения трубки в ткани пестика, но при котором происходит ингибирование роста пыльцевой трубки в разной степени и в разных частях столбика или в завязи. Они имеют место при внутривидовых и межвидовых скрещиваниях.

При внутривидовых скрещиваниях презиготная несовместимость проявляется в виде самонесовместимости. Так, большинство диплоидных видов картофеля самонесовместимы, т.е. при самоопылении у них не происходит завязывание семян из-за стойкого ингибирования и остановки роста пыльцевых трубок в верхней трети столбика пестика (Рис. 8.1).

Для многих культур (прежде всего, пасленовых) характерна система однолокусной гаметофитной самонесовместимости. Суть ее заключается в наличии в геноме вида так называемого S-локуса, который может быть представлен у конкретного генотипа разными аллелями. При совпадении S-аллеля пыльцы с одним или обоими S-аллелями диплоидного пестика, что происходит, например, при самоопылении, рост пыльцевой трубки ингибируется и останавливается. То есть, несовместимость в этом случае зависит от генотипа гаметофита опылителя и спорофита материнской формы (несет или не несет гаметофит аллель S-гена из числа тех, что представлены в пестике материнской формы).

У растений может иметь место и спорофитная самонесовместимость, которая зависит от спорофитов материнской формы и опылителя. В этом случае информацию о спорофите опылителя несет оболочка пыльцы. Спорофитная самонесовместимость характерна для крестоцветных.

С точки зрения эволюции возникновение механизма самонесовместимости имело большое значение, так как благодаря ему удается предотвратить появление заведомо неконкурентоспособных в окружающей среде организмов (из-за перехода в гомозиготное состояние полулетальных рецессивных генов).

Согласно современным представлениям о природе гаметофитной самонесовместимости S-локус содержит два основных компонента: пестичный и пыльцевой. Входящие в них гены кодируют продукты, которые экспрессируются, соответственно, в пестиках и в пыльцевых трубках. Результат гибридизации определяется взаимодействием продуктов пестичного и пыльцевого компонентов S-локуса. Продуктами пестичного компонента S-локуса являются гликопротеины, имеющие рибонуклеазную активность (S-РНКазы). S-РНКазы содержатся в пестиках вне зависимости от факта опыления, их рибонуклеазная активность является неспецифичной. S-РНКазы могут свободно проникать в цитоплазму пыльцевых трубок и, действуя как ингибитор процесса трансляции, останавливать их рост [Clarke, Newbigin 1993]. Этот своеобразный барьер могут преодолеть лишь те пыльцевые трубки, которые содержат определенные продукты, способные дезактивировать соответствующие РНКазы. В качестве кандидатов в продукты пыльцевого компонента S-локуса рассматривают так называемые SLF-протеины (F-box proteins of S locus), которые, как полагают, могут узнавать соответствующие S-РНКазы и запускать систему их деградации [Eckardt, 2004].

Корреляция в поведении видов при межвидовых скрещиваниях и при самоопылении позволила прийти к заключению, что гаметофитная самонесовместимость и межвидовая несовместимость имеют общий механизм, или, по крайней мере, общие элементы в своем механизме. В частности, описанная выше модель гаметофитной самонесовместимости может быть использована для объяснения механизмов межвидовой несовместимости у картофеля, если допустить, что процесс взаимодействия пыльцевого и пестичного компонентов S-локуса имеет видовую специфику: дезактивация соответствующих пестичных РНКаз может произойти только с помощью SLF–протеинов того же или близкородственного вида. Так, известно, дигаплоиды S. tuberosum способны скрещиваться со многими диплоидными видами картофеля из Южной Америки, которые являются для них эволюционно близкими. Следовательно, возможные различия пыльцевого компонента S-локуса у этих видов не отражаются на способности его продуктов дезактивировать пестичные РНКазы других южноамериканских видов при осуществлении межвидовой гибридизации. Диплоидные виды картофеля из Мексики – группа наиболее древних с точки зрения эволюции видов клубненосных Solanum. Очевидно, в силу дивергенции между этими видами и видами картофеля из Южной Америки различия в S-локусе у них настолько существенны, что приводит к нарушениям во взаимодействии его пыльцевого и пестичного компонентов при гибридизации между этими группами видов, результатом чего является презиготная несовместимость (см. Ермишин, 2001).

Постзиготными (постгамными) считаются барьеры, возникающие после проникновения пыльцевых трубок в завязь и оплодотворения. Чаще всего постгамная несовместимость выражается в нарушении развития эндосперма гибридного семени и, в результате, ранней гибели зародыша. У семенных растений эндосперм является одним из важнейших элементов семени, который выполняет функцию питания зародыша в ходе его развития с момента образования зиготы. Эндосперм - продукт двойного оплодотворения. Он формируется в результате оплодотворения диплоидной центральной клетки женского гаметофита одним из спермиев.

Постгамная несовместимость характерна, прежде всего, для интерплоидных скрещиваний (то есть между родительскими формами, имеющими разную плоидность). Однако во многих случаях межвидовой гибридизации удачными могут оказаться скрещивания между видами разной плоидности и неудачными – одинаковой плоидности. Так, аллотетраплоидные виды картофеля из серий Acaulia и Longipedicillata не скрещиваются с тетраплоидными сортами культурного картофеля S. tuberosum, однако легко скрещиваются с дигаплоидами S. tuberosum, а также с большинством диплоидных диких видов из Южной Америки, формируя триплоидные гибриды.

Для объяснения этих отклонений от общего правила была предложена гипотеза балансового числа эндосперма (EBN - endosperm balance number) [Johnston et al. 1980]. Согласно этой гипотезе разным видам в зависимости от их поведения в межвидовых скрещиваниях присваивается определенное EBN, которое характеризует их «эффективную плоидность». Соотношение EBN женского и мужского партнера по скрещиваниям должно быть в эндосперме 2:1, чтобы гибридный эндосперм, а, следовательно, и семя развивались нормально. То есть, для успешной гибридизации EBN родительских форм должны совпадать.

В большинстве случаев EBN вида соответствует его реальной плоидности, но может и отличаться. Так, аллотетраплоидные виды картофеля имеют эффективную плоидность 2 EBN, тетраплоидные сорта культурного картофеля и гексаплоидный S. demissum имеют 4 EBN, большинство южноамериканских диплоидных видов картофеля имеют 2 EBN, в то время как некоторые диплоидные южноамериканские виды, а также большинство диплоидных видов из Мексики, неклубненосные диплоидные виды картофеля имеют 1 EBN (таблица 8.1). Аналогичные системы описаны также для люцерны, хлопчатника, овса, пшеницы, томатов.

Таблица 8.1 Группировка видов Solanum в соответствии с их плоидностью и EBN (по Hermsen 1994)

Плоидность	EBN	Виды Solanum*
2х	1	blb, brd, cap, chn, clr, cph, cmm, crc, etb, frn, jam, lgl, mrf, pld, pnt, trf, амфимоноплоиды аллотетраплоидных видов
2х	2	chc, chm, ifd, tar, sect. Megistacroloba и Tuberosa, за исключением chn, дигаплоиды естественных и искусственных автотетраплоидов
4х	2	Все аллотетраплоиды: acl, agf,col, fen, hjt, opl, plt, pta, scr, sto, tuq; все удвоенные 2х, 1 EBN виды
4х	4	tbr subsp. tbr и adg; все удвоенные 2х, 2 EBN виды (автотетраплоиды)
6х	4	Sect. Demissa; acl subsp. albicans

*В таблице для обозначения названий видов использованы международные аббревиатуры, например, blb – S. bulbocastanum, acl – S. acaule, tbr – S. tuberosum (см. www.ars-grin.gov/nr6)

Увеличение плоидности с помощью митотического или мейотического удвоения хромосом одного из родителей с целью соблюдения правила EBN позволяет получить жизнеспособные семена с нормально развитым эндоспермом между видами с разной эффективной плоидностью.