26. Основы транскрипции.Этапы. Транскрипция — первая стадия реализации генетической информации, на которой последовательность геномной нуклеиновой кислоты копируется в виде нуклеотидной последовательности мРНК. В основе механизма копирования лежит тот же структурный принцип комплементарного спаривания оснований, что и при матричном синтезе.          Транскрипция осуществляется ферментами РНК-полимеразами. В транскрипции ДНК-геномов вирусов принимает участие ДНК-зависимая РНК-полимераза II, в редких случаях — РНК-полимераза III. В транскрипции РНК-геномов участвует уникальный вирусный фермент РНК-зависимая РНК-полимераза.          Большинство ядерных ДНК-содержащих вирусов используют для транскрипции клеточную РНК-полимеразу II. Поксвирусы (цитоплазматические ДНК-содержащие вирусы) содержат свою ДНК-зависимую РНК-полимеразу, имеющую, тем не менее, сходство с РНК-полимеразой II. Часто вирусы бактерий для ранней транскрипции своих генов используют клеточную РНК-полимеразу II, а для поздней — собственную вновь синтезированную транскриптазу. В то же время, этот фермент может входить и в состав вириона.          В 1970 г. Балтимор с соавторами продемонстрировали наличие в составе вириона вируса везикулярного стоматита РНК-зависимой РНК-полимеразы. Позже этот фермент был найден у арена-, бунья-, орто- и парамиксо-, реовирусов, то есть у вирусов с (-)РНК и днРНК-геномом. У (+)РНК-содержащих вирусов РНК-полимераза детерминирована геномом. РНК-зависимые РНК-полимеразы обладают как транскриптазной, так и репликазной активностью.          Синтез молекул РНК начинается в определенном месте матрицы, называемом промотором и заканчивается в определенном месте, называемом терминатором. Участок ДНК, ограниченный промотором и терминатором, представляет собой единицу транскрипции — транскриптон. В пределах транскриптона копируется только одна цепь, которую называют значащей или матричной. У эукариот в состав транскриптона входит один ген. Транскриптон прокариот содержит несколько генов, его чаще называют оперон. Транскрипционный цикл включает несколько стадий: связывание транскриптазы с матричной цепью, инициацию цепи РНК, элонгацию, терминацию и посттранскрипционный процессинг. Процессинг может включать кэпирование 5'-конца, метилирование гуанидина, полиаденилирование 3'-конца, сплайсинг. При рассмотрении принципов транскрипции следует различать первичную транскрипцию (синтез на геномной матрице) и вторичную транскрипцию (синтез на вновь синтезированной матрице).          Многообразие видов вирусных геномов определяет существование различных подходов к синтезу вирусных мРНК в клетке хозяина. Однако все эти подходы могут быть суммированы в единой схеме стратегии синтеза мРНК (схема).  Для того чтобы процесс транскрипции работал, должен существовать некоторый механизм идентификации того, где транскрипция должна начинаться и заканчиваться. Это достигается с помощью специальных белков, которые связываются со стартовой последовательностью генов, которые должны быть транскрибированы. Эти белки называются транскрипционными факторами. Процесс транскрипции подразделяется на несколько этапов: 1)Транскрипционный фактор узнает стартовую последовательность (промотер) гена, который должен быть транскибирован. 2)Энзим, который осуществляет синтез РНК (РНК-полимераза), связывается с транскрипционным фактором и распознает стартовый регион. 3)Энзим продолжает синтез копии ДНК до тех пор, пока не дойдет до конца гена. 4)Энзим покидает транскрипционный комплекс и высвобождается молекула РНК. Этот процесс копирования может продолжаться большое количество раз. 5)Если эта РНК будет одна кодировать белок, она покинет ядро и войдет в цитозоль. Ненадлежащая активность транскрипционных факторов показана практически для всех типов ракового заболевания, которые известны. Так как эти факторы существенны для правильной активности в клетке, неправильно функционирующие молекулы могут оказывать серьезные негативные эффекты на все другие части клетки. Если возвратиться к аналогу поточной линии, то неправильно работающие факторы транскрипции могут привести к тому, что сборочный конвейер будет работать, когда это не предполагается, создавая огромное количество продукта. С другой стороны, поточная линия может не работать, когда это необходимо, приводя к дефициту соответствующего продукта.

27. Функциональная орг. У про- и эукариот.

Синтез молекул РНК начинается в определенных местах ДНК, называемых промоторами , и завершается в терминаторах. Участок ДНК, ограниченный промотором и терминатором, представляет собой единицу транскрипции ( Lewin B., 1980 ) - транскриптон. В пределах каждого транскриптона копируется только одна из двух нитей ДНК, которая называется значащей или матричной. Во всех транскриптонах, считываемых в одном направлении, значащей является одна нить ДНК; в транскриптонах, считываемых в противоположном направлении, значащей является другая нить ДНК. Соседние транскриптоны могут быть отделены друг от друга нетранскрибируемыми участками ДНК, а могут и перекрываться, в частности так, что в пределах участка перекрывания матричными оказываются обе нити. Разбиение ДНК на множество транскриптонов обеспечивает возможность независимого считывания разных генов, их индивидуального включения и выключения. У эукариот в состав транскриптона, как правило, входит только один ген.Термины "транскрипционная единица" или "транскриптон" по смыслу близки термину "ген", но они не всегда совпадают. Так, транскрипционные единицы прокариот, как правило, заключают в себе генетическую информацию нескольких генов и называются оперонами . Продуктами транскрипции оперонов являются полицистронные мРНК , в результате трансляции которых рибосомами образуется несколько белков. Белки, кодируемые полицистронными мРНК, обычно функционально связаны друг с другом и обеспечивают протекание какого-либо метаболического процесса, например, биосинтеза определенной аминокислоты или утилизацию углеводов в качестве источника углерода. Организация генов в виде оперонов облегчает координированную регуляцию их экспрессии на уровне транскрипции. Согласованная регуляция транскрипции (и других этапов экспрессии) многих генов, не образующих одного оперона, чаще всего осуществляется специфическими белками-регуляторами, которые взаимодействуют с гомологичными регуляторными нуклеотидными последовательностями, маркирующими гены данной группы.

28. Посттранскрипционные изменения рнк у эукариотъ

Транскрипция у любого организма является первым этапом реализации генетической информации - экспрессии генов. Первичные транскрипты являются лишь предшественниками зрелых мРНК - пре- мРНК, которые перед выполнением своих функций должны претерпеть изменения, называемые посттранскрипционными модификациями. У эукариот зрелые мРНК должны быть доставлены от места их биосинтеза (ядра) к месту трансляции (цитоплазматическим рибосомам).

Одной из наиболее удивительных посттранскрипционных модификаций пре-мРНК является редактирование их первичной структуры. В результате посттранскрипционно изменяется смысл генетической информации, заключенной в соответствующем гене.

Посттранскрипционные модификации РНК особенно характерны для эукариот, у которых в силу мозаичной интрон-экзонной структуры их генов первичные транскрипты представлены гигантскими предшественниками, включающими в себя последовательности как экзонов, так и интронов. 5'-Конец предшественника мРНК чаще всего подвергается котранскрипционным модификациям, в результате которых к его 5'-концевому нуклеотиду особым образом присоединяется остаток гуанозина с образованием "шапочки" - кэпа. Эта котранскрипционная модификация создает условия для прохождения следующего этапа процессинга мРНК - сплайсинга, сопровождающегося вырезанием последовательностей интронов и объединением экзонов с образованием непрерывной кодирующей последовательности мРНК. Одновременно от 3'-конца путем эндонуклеазного расщепления отделяется избыточный фрагмент РНК, и к оставшейся части присоединяется поли(А)-последовательность. Эта совокупность реакций получила название полиаденилирования мРНК.

После таких котранскрипционных и посттранскрипционных модификаций пре-мРНК образовавшаяся зрелая, стабилизированная мРНК переносится из ядра в цитоплазму, часто к специфическому месту своей внутриклеточной локализации, где может быть депонирована или эффективно транслироваться рибосомами. Каждый из этапов посттранскрипционных модификаций может использоваться для регуляции уровня экспрессии соответствующих генов.

29. Различия свойств мРНК у про- и эукариот

Основное различие между про- и эукариотами состоит в том, что у эукариот РНК-полимераза во время транскрипции ассоциируется с мРНК-обрабатывающими ферментами, поэтому у них обработка мРНК и транскрипция могут проходить одновременно. Короткоживущие необработанные или частично обработанные продукты транскрипции называются пре-мРНК; после полной обработки — зрелая мРНК.

Другое различие между эукариотами и прокариотами — транспорт мРНК. Из-за того, что эукариотические транскрипция и трансляция пространственно разделены, эукариотические мРНК должны быть выведены из ядра в цитоплазму[5]. Зрелые мРНК распознаются по наличию модификаций и покидают ядро через ядерные поры, в цитоплазме мРНК образуетнуклеопротеидные комплексы — информосомы, в составе которых транспортируется к рибосомам. Многие мРНК содержат сигналы, которые определяют их локализацию [6]. В нейронахмРНК должна транспортироваться из тела нейронов в дендриты, где трансляция происходит в ответ на внешние раздражители [7].

Поскольку прокариотическая мРНК не нуждается в обработке и транспортировке, трансляция рибосомой может начаться немедленно после транскрипции. Следовательно, можно сказать, что трансляция у прокариот совмещена с транскрипцией и происходит ко-транскрипционно.Эукариотическая мРНК должна быть обработана и доставлена из ядра в цитоплазму, и только тогда может быть транслирована рибосомой. Трансляция может происходить как на рибосомах, находящихся в цитоплазме в свободном виде, так и на рибосомах, ассоциированных со стенками эндоплазматического ретикулума. Таким образом, у эукариот трансляция не совмещена напрямую с транскрипцией.

Так как у прокариот транскрипция совмещена с трансляцией, прокариотическая клетка может быстро реагировать на изменения в окружающей среде путём синтеза новых белков, то есть регуляция происходит, в основном, на уровне транскрипции. У эукариот из-за необходимости в редактировании и транспорте мРНК ответ на внешние стимулы занимает больше времени. Поэтому их синтез белка интенсивно регулируется на посттранскрипционном уровне. Не всякая зрелая мРНК транслируется, поскольку в клетке существуют механизмы регуляции экспрессии белков на пост-транскрипционном уровне, например, РНК-интерференция.

30. Молекулярная организация тРНК

ТРАНСПОРТНЫЕ РИБОНУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ (тРНК, трансферные РНК, адапторные РНК), низкомолекулярные РНК, осуществляющие перенос аминокислотных остатков к матричной РНК (мРНК) при трансляции (синтезе полипептидяой цепи на мРНК-матрице в рибосомах).

Присутствуют в цитоплазме и митохондриях. Цитоплаз-матич. тРНК состоят из одной полирибонуклеотидной цепи, включающей 74-95 нуклеотидных остатков (мол. м. 24-31 тыс.), митохондриальные тРНК немного короче. Для всех молекул тРНК характерно присутствие остатка фосфорной к-ты на 5'-конце нуклеотидной цепи (фосфорилирован 5'-гидроксил), наличие последовательности ССА—ОН (С-остаток цитидина, А-аденозина) на 3'-конце и неск. консервативных нуклеотидных остатков, рассеянных вдоль цепи и занимающих во всех тРНК одни и те же положения.

Отличит. особенность тРНК-присутствие в молекуле минорных нуклеозидов (миноров), общее число разновидностей к-рых в разных тРНК св. 50, а в одной молекуле тРНК их доля может достигать 25%. Они образуются путем метилирования, гидрирования и др. превращений обычных нуклеотидных звеньев в ходе посттранскрипц. модификации тРНК под действием соответствующих ферментов. Большинство миноров влияет на стабильность пространственной структуры и(или) на адапторную ф-цию тРНК-способность каждой тРНК узнавать свой кодон (участок мРНК из трех нуклеотидных остатков, кодирующий определенную аминокислоту; см. Генетический код). На присоединение к тРНК аминокислот (акцепторную ф-цию) миноры, как правило, не влияют.

Как правило, каждая аминокислота имеет неск. соответствующих ей разновидностей тРНК, незначительно различающихся по первичной структуре и наз. изоакцептор-ными; их подразделяют на мажорные (доминирующие) и минорные (малочисленные). Структурные различия обусловлены заменами неск. нуклеотидов (или пар нуклео-тидов) в разл. частях молекулы (в т.ч. в антикодоне) и существенно не отражаются на укладке цепей. Для считывания разных кодонов мРНК, соответствующих одной и той же аминокислоте, используются изоакцепторные тРНК с разнымиантикодонами. Для мн. аминокислот число соответствующих им изоакцепторных тРНК с разными антикодонами гораздо меньше, чем общее числокодонов (напр., 24 митохондриальных тРНК достаточно для узнавания 61-62 смысловых кодонов мРНК). Из этого следует, что одна и та же тРНК может узнавать неск. кодонов, кодирующих одну и ту же аминокислоту, но различающихся по одному нуклеотиду.

Число генов, кодирующих тРНК для одной и той же аминокислоты, может различаться у разных организмов более чем на порядок. Общее число геновтРНК в разл. организмах сильно варьирует (напр., у кишечной палочки Escherichia coli их ок. 70, у шпорцевой лягушки Xenopus laevis ок. 7 тыс., у человека св. 1 тыс.). При транскрипции (синтез РНК на ДНК-матрице) генов тРНК с помощью фермента РНК-полимеразы III образуютсяпредшественники тРНК (пре-тРНК). Дальнейшее их превращение в тРНК включает ряд ферментативных р-ций, приводящих к уменьшению размеровмолекул и модификации нек-рых нуклеозидов. В-генах тРНК эукариот функционально важный 3'-концевой триплет не кодирован-он достраивается посттранскрипционно с помощью фермента тРНК-нуклео-тидилтрансферазы.

В 1955 Ф. Крик предсказал существование в клетках малых молекул, ковалентно связывающихся с помощью особых ферментов с аминокислотами и участвующих в адаптации (приспособлении) аминокислот к генетич. коду, записанному в нуклеотидной форме (т. наз. адапторная гипотеза). Такимимолекулами оказались тРНК и "рН5-фер-менты", названные позднее аминоацил-тРНК-синтетазами. тРНК открыли в 1957 М. Хоглэнд, М. Стефенсон и П. Замеч-ник (США) и одновременно К. Огата и X. Нохара (Япония).

Впервые нуклеотидную последовательность тРНК установили в 1965 Р. Холли с сотрудниками (США) для дрожжевой тРНКАlа. За последующие 25 лет была расшифрована первичная структура сотен тРНК из разл. организмов (бактерии, дрожжи, млекопитающие и др.). В 1974 А. Рич с сотрудниками (США) и А. Клуг с сотрудниками (Великобритания) впервые с помощью рентгеноструктурного анализа установили трехмерную структуру дрожжевой тРНКРhе в кристалле. Позже трехмерные структуры нек-рых др. тРНК были расшифрованы в др. лабораториях.

тРНК-первые нуклеиновые к-ты, для к-рых была установлена сначала первичная, а затем трехмерная структура их молекул, что имело принципиальное значение для развития мол. биологии, химии прир. соединений и биоорг. химии.