Изучение клеточных макромолекул с помощью антител и радиоактивных изотопов

Для изучения клеточных макромолекул можно использовать практически все свойства молекул - физические, химические и биологические. При биологическом исследовании молекулы внутри клеток выявляют обычно по оптическим свойствам (в чистом виде или в комплексе с красителями), а также по биохимической активности Здесь мы рассмотрим два метода определения молекул внутри клеток: один из них включает использование радиоактивных изотопов, а другой - использование антител. Оба метода весьма эффективны для выявления определенных молекул в сложных смесях. Потенциально эти методы очень чувствительны и при оптимальных условиях дают возможность обнаруживать в образце молекулы, общее количество которых меньше 1000.

Методы выявления радиоактивных атомов отличаются высокой чувствительностью

Большинство известных природных элементов представляют собой смесь изотопов, различающихся массой атомного ядра, но имеющих, тем не менее, одинаковый набор электронов, а, следовательно, одинаковые химические свойства. Ядра радиоактивных изотопов, или радиоизотопов, нестабильны и подвергаются спонтанному распаду, образуя различные атомы. При распаде ядра испускаются заряженные частицы (например, электроны) или излучение (например, гамма-лучи), вследствие своей нестабильности в природе радиоизотопы встречаются редко, но в ядерных реакторах, где стабильные атомы подвергаются бомбардировке частицами высокой энергии, их образуется чрезвычайно много. В настоящее время многие биологические молекулы стали доступны в форме, содержащей радиоактивные атомы. Для регистрации излучения, испускаемого радиоактивными изотопами, используют различные подходы. Электроны ((3-частицы) можно определять по ионизации газа, которую они вызывают в счетчике Гейгера, или в сцинтилляционном счетчике по маленьким вспышкам света в сцинтилляционной жидкости С помощью этих методов в биологическом образце можно выявить содержание определенного радиоактивного изотопа. Наличие радиоактивных изотопов в образце регистрируют и методом радиоавтографии (по их действию на зерна серебра в фотоэмульсии). Данный метод характеризуется очень высокой чувствительностью, и в благоприятных условиях с его помощью можно зарегистрировать практически каждый распад, т. е. может быть учтен практически каждый радиоактивный атом.

Радиоактивные изотопы используют для изучения перемещения молекул в клетках и в целом организме

Один из первых примеров использования феномена радиоактивности в биологических исследованиях - изучение превращения углерода в процессе фотосинтеза. Одноклеточные зеленые водоросли поместили в атмосферу, содержащую радиоактивно меченный С0₂ (¹⁴С0₂) и облучали в разные промежутки времени солнечным светом. Затем радиоактивное содержимое водорослей фракционировали с помощью хроматографии на бумаге. Небольшие молекулы, содержащие атомы¹⁴С, происходящие из молекул С0₂, выявляли на хроматограмме, помещая поверх высушенной бумажной хроматограммы лист фотопленки. Таким образом было идентифицировано большинство основных компонентов, образующихся в процессе фотосинтеза Сахаров из С0₂. Радиоактивные молекулы можно использовать для исследования практически всех внутриклеточных процессов. Для этого обычно в ходе эксперимента в культуральную среду добавляют предшественник в радиоактивной форме: при этом радиоактивные молекулы смешиваются с присутствующими в клетках нерадиоактивными. Клетка использует оба типа молекул, поскольку они отличаются только массой атомного ядра. Изменение локализации радиоактивных молекул в клетке или их химические превращения можно проследить во времени. Чувствительность таких экспериментов во многих случаях повышают, используя метод вытеснения метки (pulse-chase) При использовании этого метода радиоактивные вешества добавляют на очень короткое время (импульсная метка), затем их удаляют и замешаю! нерадиоактивными молекулами. Образцы отбирают через различные промежутки времени и в каждой такой точке определяют химическую природу и локализацию химических веществ. Значение метода радиоактивного мечения трудно переоценить. Именно этот метод дает возможность дискриминировать химически идентичные молекулы, история которых различна - например, те молекулы, которые отличаются временем синтеза. С помощью радиоактивных методов удалось определить, что почти все молекулы живой клетки постоянно разрушаются и замещаются другими молекулами. Такие медленные обменные процессы могли бы остаться незамеченными, если бы не радиоактивные изотопы. В настоящее время промышленность производит в радиоактивной форме практически все распространенные низкомолекулярные вещества. Независимо от степени сложности биологических молекул почти каждую из них можно пометить радиоактивной меткой. Часто получают радиоактивные молекулы, в структуру которых радиоактивные атомы введены в определенных положениях. Это делают для того, чтобы получить возможность следить за независимыми превращениями, претерпеваемыми различными частями одной молекулы в ходе биологических реакций.

Одна из наиболее важных областей применения радиоактивных изотопов в биологии клетки -> то определение локализации радиоактивных соединений в срезах клеток или живых тканей методом радиоавтографии. При использовании этого метода живые клетки подвергают кратковременному (импульсному) мечению с последующей инкубацией в течение различных промежутков времени в нерадиоактивной среде. Затем клетки фиксируют и обрабатывают для проведения световой или электронной микроскопии. Каждый приготовленный препарат покрывают тонким слоем фотоэмульсии и оставляют на несколько дней в темноте - время, в течение которого происходит распад радиоактивного изотопа. Затем фотоэмульсию проявляют. Местоположение радиоактивных молекул в каждой клетке можно определить по расположению темных зерен серебра. Если инкубировать клетки с радиоактивным предшественником ДНК (Н-тимидином), то можно увидеть, что ДНК синтезируется в ядре и там же остается. И наоборот, мечение клеток радиоактивным предшественником РНК (Н-уридином) показывает, что РНК исходно синтезируется в ядре и затем быстро накапливается в цитоплазме клеток.