Инструкция по выполнению практической работы № 3

по теме: «Применение методов обнаружения и

исследования паразитов простейших кишечника человека».

Цели занятия:

1. Повторить правила работы с паразитологическим материалом, обработку и обеззараживание лабораторного оборудования и посуды.

2. Повторить строение всех видов амеб и их цисты, балантидия и его цисту, научиться определять их по таблицам, рисункам.

3. Изучить методику выполнения нативного мазок.

4. Изучить методику выполнения мазка по Люголю.

Исходный уровень знаний и навыков.

Учащийся должен знать:

1. Режим и правила работы с паразитологическим материалом.

2. Строение всех видов амеб и их цисты, балантидия и его цисту.

3. Основные правила техники безопасности при работе в паразитологической лаборатории.

Учащийся должен уметь:

1. Выполнить нативный мазок.

2. Выполнить мазок по Люголю.

3. Определить строение всех видов амеб и их цисты, балантидия и его цисту, по таблицам, рисункам.

Структура занятия.

1. Теоретическая часть:

• Актуализация темы.

2. Практическая часть:

• Выполнение нативного мазка.

• Выполнение мазка по Люголю.

• Определение строения всех видов амеб и их цист, балантидия и его цисты, по таблицам, рисункам.

Актуализация темы. Исследование испражнений.

Сбор и доставка материала. Испражнения (кал) исследуют с целью обнаружения простейших кишечника.

Движение простейших — один из самых характерных признаков, который позволяет поставить правильный диагноз. Поэтому основным правилом, которое следует строго выполнять, является исследование только свежего материала, не позже, чем через 20 мин после его выделения. При подозрении, например, на амебную дизентерию целесообразно исследование проводить тут же, в отделении, или срочно доставить собранную пробу испражнений в лабораторию и немедленно приступить к микроскопии.

При невозможности немедленного исследования испражнения помещают в консервант. Исследование оформленного кала, в котором содержатся цисты простейших, допускается в течение суток.

Амбулаторных больных обследуют после принятия солевого слабительного.

Фекалии собирают в чистую водонепроницаемую сухую посуду (стеклянные банки), которая так же, как и использованные для сбора горшки или судна, не должны содержать остатков дезинцифирующих веществ.

Сохранять пробу до исследования следует при комнатной температуре в вытяжном шкафу. Повышенная температура окружающего воздуха ведет к быстрому отмиранию вегетативных (подвижных) форм простейших.

Доставленные в лабораторию свежевыделенные испражнения осматривают, отмечают наличие слизи, крови, консистенцию. В первую очередь выбирают и исследуют неоформленные фекалии с патологическими примесями, так как именно в них скорее всего можно обнаружить подвижные формы патогенных простейших.

Обязательным является исследование нативного мазка и мазка, окрашенного раствором Люголя.

Исследование биологических материалов.

Желчь и содержимое двенадцатиперстной кишки, полученные при дуоденальном зондировании, осматривают и выбирают комочки слизи на предметное стекло и микроскопируют. Кроме того, материал центрифугируют, просматривают под микроскопом осадок. С помощью этого метода можно обнаружить вегетативные стадии лямблий.

Спинномозговую жидкость, полученную при пункции, центрифугируют и исследуют осадок. Из осадка готовят нативные мазки, окрашивают их по Романовскому и микроскопируют. В препаратах можно обнаружить патогенных свободноживущих амеб, токсоплазм, трипаносом.

В гное, извлеченном при пункции абсцессов внутренних органов, микроскопически можно обнаружить амеб. Из язв толстого кишечника во время ректороманоскопии получают отделяемое и немедленно микроскопируют — при этом можно выявить подвижные вегетативные стадии (эритрофаги) дизентерийной амебы.

Мокроту исследуют в нативном мазке, а также окрашивают раствором Люголя. В мокроте можно обнаружить пневмоцисты, изредка ротовые амебу и трихомонаду.

Костный мозг исследуют с целью обнаружения лейшманий и некоторых других простейших. Получают костный мозг при пункции грудины, гребня подвздошной или головки большеберцовой костей, готовят мазки на предметных стеклах и микроскопируют после окраски по Романовскому.

Следует учитывать, что за лейшманий иногда ошибочно принимают:

1) кровяные пластинки или «осколки» клеток (комочки цитоплазмы, содержащие ядерное вещество), встречающиеся в мазках костного мозга;

2) посторонние микроорганизмы, одноклеточные водоросли и другие, попавшие в мазок во время окраски. В мазке они окрашиваются более интенсивно, чем лейшманий — цитоплазма темно-синего цвета, ядро ярко-малиновое, кинетопласт отсутствует.

При кожных поражениях исследуют мазки в случае подозрения на кожный лейшманиоз.

Не рекомендуется брать материал для мазка непосредственно из язв, так как наличие микрофлоры и остатков разрушенных клеток затрудняет поиски лейшманий. После предварительной обработки антисептиком кожи, область вокруг язвы сжимают двумя пальцами и в зоне инфильтрата по краю язвы делают поверхностный соскоб острым скальпелем. Мазок готовят из выступившей капли серозно-кровянистой жидкости или материала, полученного при соскобе.

Мазки сушат на воздухе, фиксируют и красят по Романовскому. В препарате должны быть хорошо различимы клетки инфильтрата — макрофаги, эндотелиальные, плазматические, лимфоидные клетки, фибробласты и небольшая примесь клеток периферической крови. Наличие в препарате эпителиальных клеток, бесструктурных глыбок, окрашивающихся в равномерно сиреневый цвет, означает, что соскоб был взят поверхностно и должен быть повторен. В мазке не должно быть слишком много крови, а также гноя и бактерий.

Лейшманий обнаруживают в макрофагах, а также вне клеток в виде округлых, овальных или удлиненных телец размером 3—5 мкм.

Лимфатические узлы пунктируют; полученный материал используют для приготовления окрашенных мазков, посева на питательные среды и биологической пробы с целью обнаружения лейшманий, трипаносом, токсоплазм.

В некоторых случаях приходится исследовать кусочки органов или тканей, полученных во время операции (биопсия) или вскрытии (аутопсия). В частности, это необходимо для обнаружения токсоплазм и их цист в гистологических срезах из головного мозга, печени, селезенки, а также пневмоцист в препаратах из легких.

Нативный мазок.

Препарат готовится на предметном стекле. Жидкие кровянисто-слизистые испражнения без видимой примеси фекальных масс могут быть исследованы без добавления изотонического раствора хлорида натрия. Деревянной палочкой каплю испражнений переносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. Пользоваться стеклянными палочками не рекомендуется, так как ими не удается набрать слизистые комочки.

В правильно приготовленном нативном мазке фекалий покровное стекло должно плотно прилегать к предметному, с равномерным распределением жидкости между стеклами, без ее выступания за пределы покровного стекла. Густой мазок мало прозрачен. Если же взято слишком мало фекалий, то мазок получится разведенным и простейших в нем может просто не оказаться. Через правильно приготовленный мазок должен быть виден печатный текст.

При микроскопическом исследовании освещение не должно быть ярким, иначе можно пропустить прозрачные объекты. Передвигать препарат наиболее удобно препаратоводителем. По мере ориентировочного просмотра под малым увеличением обязательно применяют среднее увеличение (х10,х40).

В нативном мазке обнаруживаются подвижные формы простейших, по особенностям движения можно дифференцировать отдельные виды. Цисты отличаются постоянной формой и наличием оболочек. Строение цист видно плохо, не просматриваются ядра. Поэтому исследуют и мазок, окрашенный раствором Люголя.

Окраска раствором Люголя.

Состав раствора Люголя по унифицированной методике: иодид калия — 3 г; кристаллический иод — 1,5 г; вода дистиллированная — 100 мл. Вначале растворяют иодид калия, затем иод. Раствор стабилен в темной посуде с притертой пробкой при комнатной температуре не более месяца.

Цисты окрашиваются в золотисто-коричневый цвет. На фоне цитоплазмы заметны ядра, видны их строение и число. Хорошо виден гликоген, окрашивающийся в разные оттенки коричневого цвета. При окраске раствором Люголя вегетативные формы погибают и определяются с трудом.