Цитогенетический метод.

Цитогенетический метод основан на микроскопическом исследовании хромосом -кариотипа (индивидуального набора хромосом) и полового хроматина. Позволяет выявлять

1.Геномные мутации:

а) полиплоидии,

б) анеуплоидии - трисомии 2п + 1 (с. Дауна, Эдварса, Патау, Клайнфельтера),

- моносомии 2п - 1 (Тернера - Шерешевского),

- нулисомии 2п -2

в) мозаицизм 46/45 хромосом в группах клеток

2. хромосомные абберации –

-транслокации (с. Дауна),

- делеции (с. «Кошачьего крика», Вольфа - Хиршхорна)

3. микрохромосомные перестройки при моногенных синдромах (филадельфийская хромосома - делеция 21 хромосомы - миелолейкоз - белокровие)

Этапы цитогенетического метода:

• подбор клеточного материала,

• культивирование соматических клеток на искусственных питательных средах (клетки человека быстро размножаются на питательных средах)

• добавление ФГА - фитогемагглютинина - стимулятора митоза,

• добавление колхицина - мутагена разрушающего веретено деления во время митоза, для остановки митоза на стадии метафазы

• обработка клеток гипотоническим раствором, вследствие хромосомы набухают, рассыпаются и лежат свободно

• окрашивание хромосом

• изучение под микроскопом, фотографирование

• вырезание и построение идеограммы

Основные сведения о морфологии хромосом человека получены при изучении их в метафазах митоза прометафазе-метафазе мейоза. При этом важно, чтобы количество делящихся клеток, было достаточно велико.

Подбор клеточного материала. Культивирование

Препараты хромосом можно приготовить из всех тканей и клеточных суспензий, содержащих делящиеся клетки. У человека в большинстве случаев используют препараты из клеток костного мозга, кратковременной культуры крови или из длительной культуры фибробластов кожи. Используют биоптаты семенников, спущенные эмбриональные клетки плода (аминиоцентез), плацетобиопсия (биопсия плода- хорионобиопсия и плаценты).

Наиболее простым и доступным методом является культивирование клеток крови. Пункция костного мозга или биопсия кожи для культивирования фибробластов технически сложнее, и к тому же аспирация костного мозга- весьма неприятная процедура. Препараты из костного мозга имеют, однако, то преимущество, что дают возможность изучать митозы in vivo, вне культуры клеток, а сразу после взятия материала у пациента.

В крови здоровых людей нет делящихся клеток. Однако митоз этих клеток можно стимулировать искусственно, обработав их стимулятором митоза фитогемагглютинином ФГА. Берут один миллилитр периферической крови. Суспензию лейкоцитов выращивают в культуральной среде in vitro 72 часа и затем готовят препараты хромосом. Чтобы остановить клетки в прометафазе. подавляют образование веретена деления веществами с колхицином. Для свободного распределения хромосом в плоскости препарата клетки обрабатывают гипотоническим раствором. Затем каплю суспензии наносят на стекло и окрашивают.

Окрашивание.

Наиболее простой способ окрашивания - простая рутинная сплошная по всей длине хромосомы основным (щелочным) красителем Гимза или 2% - ным ацстоорссином или ацегкармином. Эти красители окрашивают хромосомы целиком, равномерно и интенсивно. Для выявления численных аномалий хромосом этот метод вполне достаточен.

Для получения более детальной картины структуры хромосом или их сегментов используют различные способы дифференциального окрашивания. Методы дифференциальной окраски хромосом основаны на действии солевых растворов с определённым Ph, температурным режимом, обработкой ферментами Протеазами. Этими методами установлена четкая структурная разнородность хромосом по длине на красящиеся (тёмные - гетерохроматин) и некрасящиеся (светлые - эухроматин) полосы. Рисунок этих полос специфичен, индивидуален для каждой пары хромосом. Рисунок сегментации зависит от особенностей неоднородности целостного комплекса ДНК - белок в разных участках по длине хромосом. Различные типы сегментов обозначают по методам, с помощью которых они выявляются наиболее отчетливо. Способы дифференциального окрашивания: Q, G, R, С, Т - окрашивание.

а) Q - сегменты (quinacrine, акрихин) - участки хромосом способных связывать флюорохромы, флюоресцирующие (яркое свечение) после окрашивания акрихин - ипритом. Q - сегменты

соответствуют участкам богатым AT парам (55 - 65%) ДНК и содержат тканеспецифические гены, реплицирующиеся во второй половине S - периода интерфазы. Преимущество Q метода состоит в том, что позволяет даже в интерфазном ядре идентифицировать «У» хромосому человека по яркой флуоресценции в виде парных светящихся точек. Для просмотра таких препаратов используют люминесцентный микроскоп.

б) G - сегменты (Gitmsa, Гимза) выявляются при окрашивании красителем Гимза в сочетании с дополнительными протеолическими процедурами, которые способствуют тому, что краситель адсорбируется наиболее интенсивно на определённых G - сегментах (образуя тёмные диски -гетерохроматиновые участки и светлые - эухроматиновые). Этот метод чаще используют в повседневной работе большинства лабораторий, поскольку он не требует использование флуоресцентного микроскопа. Q и G сегменты совпадают. К разновидностям окрашивания по методу Гимзы относятся R и С — окрашиваемое.

в) R - сегменты (reverse, обратные) окрашиваются после тепловой денатурации и располагаются между Q и G сегментами. Окрашенные и неокрашенные сегменты располагаются обратно тому, что наблюдается при G и Q - окрашивании. R- сегменты, соответствуют участкам богатым ГЦ - парам (50 - 60%) ДНК. которые более устойчивы к тепловой денатурации. Они содержат общеклеточные гены, реплицирующиеся в первой половине S - периода интерфазы (на G и Q окрашенных хромосомах эго светлые - эухроматиновые участки). На R — окрашенных хромосомах это тёмные эухроматиновые. Гетерохроматиновые и околоцентромерные районы остаются светлыми

г) С- сегменты (constituve heterochromatin, конститутивный гетерохроматин) окрашивают прицентромерные районы хромосом, более устойчивые к химическим и физическим повреждениям. В этих участках ДНК с многократно повторяющимися последовательностями. С -окрашивание позволяет выявить сегменты центромерных участков коротких плеч 13, 14, 15, 21, 22, и У хромосом. Это окрашивание выявляет, структурный, или конститутивный гетерохроматин.

д) Т - сегменты, окрашивание теломерпых концевых зон хромосом.

Достижения молекулярной цитогенетики позволили внедрить в клиническую цитогспстику новых технологий, таких как ДИК диагностика, гибридизация нуклеиновых кислот на препарате in siti. а также компьютерных систем для анализа хромосом. ДНК диагностика основана на использовании технологии рекомбинантных молекул ДНК для выявления молекулярно генетического дефекта хромосом. Флуоресцентная гибридизация на препарате in siti FISH -Fluorescent In Situ Hybrization включает применение специально подготовленных (флюоресцирующих) ДНК проб. ДНК - зонды представляют собой клонированные фрагменты генома человека для выявления генетических дефектов на хромосомном уровне. При этом используется многоцветовая флуоресцентная

in siti гибридизация ДНК на препарате метафазных хромосом или интерфазных клеток для маркировки хромосом или их участков. Данная диагностика, охватывает практически весь спектр хромосомных аномалий, что в первую очередь позволяет выделять редкие хромосомные синдролш. Метод FISH может применяться и для диагностики анеуплоидий в интерфазных ядрах.

Классификация хромосом

Развитие цитогенетики

Для того чтобы легче было разобраться в сложном комплексе хромосом, образующих кариотип, их располагают в виде идиограмм (своеобразной записи). Составление идиограмм, как и сам термин предложил советский цитолог С.Г. Навашин (1857 - 1930). В идеограмме хромосомы располагаются в порядке убывающей величины. Исключение составляют половые хромосомы X и У, которые располагают в конце. В 1956 г. цитологии Д.Тио и Л. Леван установили, что у человека 46 хромосом (а не 48, как думали раньше). В I960 г. в Денвере (США) была разработана первая Международная классификация хромосом человека. В основу которой легли: - размеры хромосом (большие, средние, маленькие),

- форма (метацентрические. субметацентрические, акроцептрические),

- положении центромеры - центромерами индекс - количественная характеристика, определяемая положением первичной перетяжки. Представляет отношение длины короткого плеча хромосомы к длине всей хромосомы, принятой за 100%. Если центромернып индекс равен 50%, то это метацеитрическая хромосома, меньше 50% ~ субметацентричестя.

Все пары аутосом были пронумерованы:

• арабскими цифрами (I, 2, 3 ...22 -аутосомы, самая большая аутосома имеет первый номер, а самая маленькая аутосома -22)

• разделены на семь групп (1 - 7), обозначенных латинскими буквами -А, В, С, Д Е, F, G. Половые хромосомы обозначены латинскими буквами X и У

В 1971 г. на IY Пражской конференции генетиков в дополнение к Денверской классификации были представлены методы дифференциальной окраски хромосом (выявление чередующихся сегментов -тёмных и светлых по длине хромосомы), благодаря которым каждая хромосома приобретает своей неповторимый рисунок, что помогает точной идентификации.

Группа А (1 -3) -6 хромосом, три наиболее крупных хромосом; первая и третья пары метацентрические, а вторая умеренно субметацентрическая

Группа В (4 - 5) - 4 хромосомы, две пары длинных больших субметацентриков, неразличимых по размеру и морфологическим признакам.

Группа С (6 - 12) - 14 хромосом, семь пар аутосом средней величины с субмедиално расположенной центромерой. К этой группе относится половая Х-хромосома, она сходна с самыми крупными хромосомами из группы С - 6 и 7.

Группа Д (13 - 15) - 6 хромосом, три пары больших (средней величины) акроцентриков не различимых между собой.

Группа Е (16 - 18) - 6 хромосом, три пары малых субметацентрических хромосом 16 - хромосома имеет почти медианную локализацию центромеры, а 18 пара хромосом более акроцентрична, т.е отлтчается меньшей длиной коротких плеч

Группа F (19- 20) -4 хромосомы, две пары маленьких метацентриков

Группа G (21 - 22) - 4 аутосомы, две пары мелких акроцентриков. Эти хромосомы неразличимы. К этой группе относится У-хромосома (мелкий акроцентрик) Половые хромосомы X и У распределяются в конце идеограммы.

Анализ фотокариограммы нормального кариотипа человека.

Хромосомы окрашены простым рутинным способом, краситель распределяется равномерно по всей длине хромосомы, полому они подлежа! группой идентификации.

На фотографии метафазной пластинки (46, XX - женский кариотип или 46,ХУ -мужской кариотип) находят хромосомы и обводят (в кружок):

1. первыми выделяют группу G - красным карандашом маленькие акроцентрики группы G 21,22 пары - их 4 - две пары, если это женский кариотип (46. XX) или 5 акроцентриков, если это мужской кариотип (46, ХУ) с акроцснтричсской У хромосомой идендифипируемой с хромосомами группы G.

2. вторыми выделяют группу Д, и обводят синим карандашом крупные акроцентрики группы Д 13-15 три пары аутосом - их 6 .

3. третья группа выделяют группу Е - коричневым карандашом - их 6 аутосом - 3 пары . Хромосомы группы Е (16 - 18 пары) идентифицируют индивидуально: 16- хромосома -более метацснтрик, 17-ая-субметацентрик, 18-ая -более акроцентрическая хромосома. Это хромосомы мелких размеров, они выделяются

4. четвёртая группа выделяют группу F - зеленым карандашом выделяют маленькие метацентрики группы F 19, 20 пары, их 4 - 2 пары,

5. прятая группа выделяют группу А. Далее идентифицируют хромосомы группы А: 1-я пара - самые большие метацен грики, 2-я пара хромосом - самые большие субметацентрики и 3-я пары хромосомы большие метанентрики, но меньше первой пары хромосом. Выделяют эти хромосомы черным (простым) карандашом - их 6 - 3 пары.

6. шестая группа выделяют группу В. Хромосомы Группы В - типичные субметацентрики крупных размеров (4, 5 пары). Их отмечают произвольно, возле каждой хромосомы ставят номер (4,4 5.5)

7. седьмая группа С. Оставшиеся хромосомы - это хромосомы группы С и X - половые хромосомы подлежат групповой идентификации. Хромосом группы С их 14 аутосом.Они средних размеров, типичные субметацентрики Выделяют эти хромосомы .желтым карандашом 6 последнюю очередь.

Половые хромосомы: X - хромосому выделяют желтым вместе с хромосомами группы - С

У-красным карандашом - маленький акроцентрик, похожа на хромосомы группы G. Затем на метафазной пластинке подсчитывают общее число хромосом. В нормальном кариотипе человека оно равно 46.

Определяют пол по количеству самых мелких акроцентрических хромосом из группы G и хромосом из группы С:

Если кариотип - 46, XX - женский, то в группе С будет 16 хромосом: из них 14 аутосом группы С плюс две половые Х-хромосомы. А в группе G -4 - акроцентрика

Если мужской кариотип 46, ХУ, то в группе С будет 15 хромосом: 14 - аутосом группы С и одна половая Х-хромосома и в группе G - пять акроцентриков

Идентифицированные хромосомы вырезают, раскладывают по группам. А, В, С. D, E, F, G, нумеруют пары от 1 по 22 и приклеивают в альбом. Половые хромосомы располагают в конце идеограммы.

Символика хромосом

Кариотип человека в норме и при хромосомных заболеваниях требуют унифицированной шволики хромосом. В настоящее время исследователи всего мира клинические генетики, ^вропатологи, педиатры, психологи, психиатры используют «Международную систему для потогенетической номенклатуры хромосом человека». Согласно последней номенклатуре такие орфологические признаки хромосом, как теломеры, центромеры, специфические полосы по тине хромосомы, используются в качестве сравнительных знаков. В хромосоме выделяют -кроткое - р и длинное - q плечи хромосом. В каждом плече выделяют районы, полосы и ;гменты. которые пронумерованы от центромеры к теломеры. например, запись - 6 q 2,3 называет на то, что это хромосома 6, длинное плечо q, район 2. сегмент 3. Районы и сегменты на ромосомах проявляются после дифференциального окрашивания хромосом различными етодами Q, G, R, С, Т.

В номенклатуре существует следующие обозначения для описания нормальных фиотипов 46, XX девочка и 46, ХУ мальчик. В начале кариотипа записывается общее число хромосом, включая половые хромосомы. Затем записываем половые хромосомы.

Численные аномалии обозначаются изменением числа хромосом в кариотипе и указанием -) или (-) той или иной присутствующей или отсутствующей хромосомы. Исключением являются половые хромосомы, при количественных аномалиях которых (+) или (-) никогда не говорится. Причём отсутствие одного из гомологов хромосом или его части (деления) в кариотипе, несмотря на тип мутации (численной или структурной), носит название моносомии - полной или ici ичной, а присутствие - трисомии полной или частичной. Полиплоидии отражаются только целом хромосом (69).

АУТОСОМНЫЕ ГЕНОМНЫЕ АНЕУПЛОНДИИ

начале кариотипа записываем общее число хромосом, включая половые хромосомы. Затем шисываем половые хромосомы. Знак плюс или минус ставится перед хромосомой для указания а добавочную или отсутствующую хромосому.

Существует три цитогепетических формы синдрома Дауна: регулярная (простая) рисомин (93%), траислокационная (5%), мозаичная (2%). Регулярная трисомия синдрома ,Дауна в цитогенетической номенклатуре записывается как 47,ХХ,+ 21(девочка) и 47,ХУ,+21(мальчик). Показано, что критический сегмент, отвечающий за фенотипическос проявление синдрома Дауна, расположен в участке 21q22.

Синдром Патау - цитогенетически различают три формы: простая трисомии (75%), ранслокационная (20%), мозаичная (5%), Простая триеомия синдрома Патау формула ариотипа 47,ХХ,+13(девочка)_:, 1: 1 47,ХУ,+13(мальчик)

Синдром Эдварса 47,ХХ,+18 девочки рождаются значительно чаще

Запись ГОНОСОМНЫХ АНЕУПЛОИДИЙ:

синдром Тернера - 45,ХО, (девочка) полная моносомия, существует несколько цитогенетических дриаптов, в том числе мозаичных форм

яндром трипло - «X» - 47, XXX (девочка) полная трисомия

дндром Клайнфельтера - 47, ХХУ, (мальчик), существует несколько цитогенетических ариантов синдром дисомии по «У» хромосоме 47, ХУУ (мальчик).

Структурные аномалии типа делеций, дупликаций, инверсий, ннсерций и раислокаций обозначают как: del(-), dup(+), inv, ins и t соответственно, центрические обертсоновекие - rob. Когда необходимо обозначить какой - либо участок при описании [юмалий хромосом, то вначале пишут число хромосом в кариотипе, затем номер хромосомы к оторой произошла мутация, йотом символ плеча (р или q) и знаки плюс или минус записываем осле символа плеча. 46,ХХ, del, X р - женский кариотип с 46 хромосомами и делецией длинного леча X - хромосомы. 45,ХХ, rob 15,16 - кариотип с 45 хромосомами и робертсоновской эанслокацией, 46,ХУ, t 2,5, q21, q31 -транслокация произошла между сегментами 21 и 31 яитшых плеч 2 и 5 хромосом.

Запись АУТОСОМНЫХ АББЕРАЦИЙ:

Синдром Вольфа — Хиршхорна - частичная моносомия - делеция (утрата части генетического материала) короткого плеча 4 хромосомы 46,4 р ,ХУ, утрата сегмента р 16 синдром «крика кошки» - частичная моносомия □ деления короткого плеча 5 хромосомы, 46,5р ~,ХХ, утрата сегмента р 15, описаны мозаичные формы

Филадельфийекая хромосома Ph - делеция 21 хромосомы, впервые описана в Филадельфии. Она выявляется только в клетках кроветворной системы - костного мозга, гранулоцитах. Мутантная клетка вытесняет нормальные кроветворные. У носителей этой мутации развивается хронический миелолепкоз. При синдроме Дауна острый лейкоз возникает в 10-20 раз чаще, чем среди общей популяции.

транслокационные центрические робертсоновские - rob формы:

синдрома ДАУНА - 46,t 21/21,XX; 46,t 21/15,ХУ ( чаще на 15, реже 14, еще реже на 21, 22 и У хромосомы); синдрома ПАТАУ - 46,113/13, XX; 46,t 13/15,ХУ.

Мозаичные формы

Эта группа заболеваний, вызванная соматическими мутациями на первых стадиях онтогенеза дробления. Дети - мозаики могут появляться у здоровых родителей.

При мозаицизме mos обозначают кариотип каждого аномального и нормального клона клеток, после чего записывают в скобках [ ]. Число проанализированных клеток, кариотипы разных клонов обозначают косой чертой /. Нормальный клон всегда обозначается последним Мозаичный синдром Дауна mos 47,ХХ, +21 [60]/46,ХХ|40], запись кариотипа говорит О том, что у девочки с мозаичной формой с. Дауна при анализе 100 клеток обнаружено 40 клеток с нормальным кариотипом и 60 клеток с простой трисомией по 21 хромосоме. Мозаичный синдром Тернера 45,ХО, [801/ 4б,ХХ [201 или 45,ХО[301/ 47,ХХХ[70|

ПОЛОВОЙ ХРОМАТИН

В 1949 г. Ьарр и Бертрам в ядрах нейронов самок кошек обнаружили интенсивно, окрашенную гльтбку хроматина. Она имела треугольную форму и прилежала к внутренней мембране ядра. Далее было установлено, что только одна из двух Х-хромосом в соматических клетках женских особей функционально активна, другая конденсируется (факультативные гетерохроматин), и в интерфахпом ядре образует Х-хроматин, или тельце Барра. В норме у женщин (46. XX)-одно тельце Барра, у мужчин (46, ХУ) оно отсутствует. Изменение числа Х-хромосом ведёт к изменению числа телец Барра.

Количество телец Барра всегда на единицу меньше, чем количество половых Х-хромосом в кариотипе. Сумма п X— 1. Этот феномен получил название правила С Т К) А Р Т А. Например, если кариотип 47, XXX, то три Х-хромосом минус одна, равняется два тельца Барра, Увеличение числа У-хромосм приводит к увеличению флуоресцирующих телец в интерфазных ядрах, названных У-хроматином. Выделяют половой хроматин в клетках буквального мазка эпителия. Используют определение полового хроматина для:

• Своевременное определение пола в решении вопросов, о наследственных сцепленных с полом заболеваний,

• Экспресс-диагностики хромосомных болезней, связанных с нарушением комплекса половых хромосом это с. Клайнфельтера 47, ХХУ. 48, ХХХУ, Тернера 45, ХО, Морриса 46, ХУ - женский фенотип, трипло - X - суперженщина 47, XXX, дисомию по У-хромосоме 47, ХХУ. Возможность выявить мозаицизм по половым хромосомам - гинандроморфизм -ХХУ/XXпроявляются как, женские так и мужские признаки. Описаны самые разнообразные формы кариотипов ХУ/ХО. ХХ/ХО, ХХХ/ХО.ХХ/ХХХ, тройные .пазанки ХО/ХХ/ХХХ.

• Определение пола в судебной медицине

• В онкологии для определения опухоли по половому хроматину и выбора правильного гормонального лечения

Цитогенстический метод применяется для:

1. диагностики хромосомных и геномных болезней

2. изучения хромосомных и геномных мутаций

3. определения пола при нарушении половой дифферспцировки фенотипа

4. изучения полоного хроматина

Метод генетики соматических клеток

Этот метод представляет собой культивирование, клонирование, гибридизацию и селекцию соматических клеток. КЛОНИРОВАНИЕ - получение потомков (большого числа клеток) от одной клетки за счет деления. Клонированные клетки используют для получения большого числа клеток для хромосомного анализа, для изучения особенностей обмена, для количественного учета мутаций, для доказательства гетерогенности клеточных популяций. Селекция в генетике соматических клеток применяют для отбора мутантов по резистентности, ауксотрофпости. Отбор мутантов по резистентности основан на их выживании в присутствии, какого -либо летального фактора. Отбор ауксотрофных клеток основан па их свойствах использовать для своего роста строго определенные вещества, не синтезируемые клеткой. Путем гибридизации устанавливается локализация генов в хромосомах. Гибридизация основана на слиянии совместно культивируемых клеток двух разных типов. Гибридные клетки или гетерокарионы, содержат ядра с хромосомными наборами двух разных видов, например человека и мыши, человека и крысы, человека и китайскою хомячка. Генотипы таких клеток находятся в состоянии дисбаланса и поэтому при клеточном делении гетерокарионы обычно теряют часть хромосом. В разных гибридных клетках утрачиваются хромосомы одного вида. В гибридных клетках «человек - мышь» постепенно исчезают хромосомы человека. Постепенная утрата хромосом человека может привести в конечном итоге к сохранению единственной хромосомы. Так сохранение 9 хромосомы человека в гибридной клетке «человек - мышь» позволило установить, что в ответ на введение вируса клетки этого клона начали вырабатывать интерферон. Поэтому установили, что ген ответственный за синтез интерферона расположен в 9 хромосоме.

Методы моделирования

Разработаны, два метода: биологическое и математическое моделирование. С помощью этих методов решаются разные задачи. имеющее значение как для разработки теоретических основ генетики человека, так и для практического медико-биологического консультирования. Биологическое моделирование это использование животных имеющих наследованные аномалии, соответствующие аномалиям человека. Используется в генетике Оля:

1. изучения патогенеза наследственных заболеваний.

2. разработки методов их лечения.

Математическое моделирование основано на использовании компьютерных технологий. С помощью этого метода изучаются:

1. Распространение мутаций в популяциях при разных условиях действие отбора;

2. Влияние экспериментальных эволюционных факторов в разных сочетаниях на генофонд популяций при распространении наследственной патологии.

3. Эффект сцепленного наследования при анализе большого количества сцепленных генов

4. в медико -генетическом консультировании для прогноза потомства.

Сytogenetic method.

The cytogenetic method is based on microscopic research of karyotype and used for studying structure of a chromosomal complement or separate chromosomes.

The cytogenetic method is used for:

1.diagnostics of chromosomal and genome illnesses

2.studying of chromosomal and genome mutations

3.definitions of a sex at infringement of a sexual differentiation of a phenotype

For studying of a sexual chromatin, duly definition of a sex in the decision of questions about hereditary of the diseases linked to a sex, and also at diagnostics of the hereditary diseases connected with aneuploidy on sexual chromosomes (ХО, ХХУ, ХХУУ, XXX)

Stages of a method:

The main condition of cytogenetic diagnostics is a presence of dividing cells in a cytology preparation.