26 Лекция 18. Малоугловое рассеяние биомакромолекул в растворе

Лекция 18. Малоугловое рассеяние биомакромолекул в растворе

Методы малоуглового рассеяния рентгеновских лучей и нейтронов становятся одними из самых мощных при изучении структуры биологических макромолекул в растворе. Ввод в строй интенсивных нейтронных и синхротронных источников позволяет сегодня получать кривые рассеяния в широком интервале углов за небольшое время, что делает их незаменимыми методами изучения структуры с низким и средним пространственным разрешением.

Теория малоуглового рассеяния от частиц в растворе

Малоугловое рассеяние (МУР) является весьма информативным методом в биологии. С его помощью удается получить данные о массе, размерах, форме и взаимодействии молекул в растворе. Но хорошее понимание малоуглового рассеяния требует математических выкладок, что может быть затруднительным для биолога. Тем не менее, метод заслуживает внимания, поскольку он весьма эффективен и не требует кристаллизации образца.

Малоугловое рассеяние без уравнений.

Рассматриваемые вопросы в малоугловом рассеянии сводятся к следующим:

1) Каково эффективное состояние белка или другой макромолекулы в растворе или в мембранном окружении? Существует ли он в растворе как мономер или димер (тример)?

2) Какова форма макромолекулы или её конформация в растворе (является ли она компактной и глобулярной или эллипсоидальной, длинной и узкой, плоской и широкой, звездообразной или разветвленной . . ?

3) Aналогична ли структура макромолекулы в растворе её структуре в кристалле. . ?)

4) Взаимодействуют различные молекулы в растворе, чтобы образовать комплекс, или нет? Имеются ли изменения в конформации макромолекулы или во взаимодействии между макромолекулами при образовании комплекса?

5) Насколько различаются ответы на вопросы 1, 2, 3 в зависимости от условий раствора (рН, соль, лиганд, температура . . .)?

Метод вариации контраста в малоугловом нейтронном рассеянии (МУРН) позволяет сделать видимым только один компонент внутри сложной структуры. Тогда становится возможным рассмотреть вопросы 1–4 для отдельных компонентов, например, макромолекулярного комплекса,, а также взаимодействие комплекса белок – нуклеиновая кислота или мембранный белок в липидном окружении или в среде детергента.

Важный нюанс − получение ответов на приведенные выше вопросы происходит независимо друг от друга. Например, исследование методом малоуглового рассеяния даст достоверную информацию, что частица является мономерной (вопрос 1) с весьма вытянутой формой (вопрос 2).

Практическими требованиями к проведению экспериментов с применением малоуглового рассеяния являются:

1) Раствор порядка 100 μл, содержащий несколько миллиграммов вещества на миллилитр.

2) Точное измерение концентрации макромолекул (в миллиграммах на миллилитр).

3) Доступ к камере рентгеновского или нейтронного малоуглового рассеяния.

Разбавленные растворы тождественных частиц

Чтобы добиться различимого сигнала в рентгеновском или нейтронном малоугловом рассеянии, нам понадобиться раствор порядка 100 μл, содержащий несколько миллиграммов макромолекул на миллилитр, что соответствует приблизительно 10¹⁵ частиц для 50 кДа белка при концентрации 1 мг·мл⁻¹. Отметим, что такая концентрация − обычная единица измерения в биохимии, фактически она равна 1 г·л⁻¹, единице, которую более удобно использовать в уравнениях.

Рассмотрим вначале состояние раствора, когда частицы не оказывают влияния друг на друга, т.е. положение и ориентация каждой из них являются полностью независимыми от положения и ориентации соседних. Это состояние соответствует так называемому бесконечному разбавлению, когда взаимодействие между частицами отсутствует. На практике это достигается при различных концентрациях для различных макромолекул и растворов. Например, такое состояние вполне может соблюдаться для данного белка при нескольких мг в мл в буфере с нейтральным рН. Но молекулы тРНК, которые становятся высокозарядными при рН 7 в слабосолевом буфере, взаимодействуют друг с другом даже при таких концентрациях, поэтому не всегда представляется возможным достичь состояния бесконечного разбавления без увеличения концентрации соли в растворе. Чтобы убедиться в том, что желаемое все же достигнуто, следует провести измерения для нескольких концентраций и экстраполировать к нулевой концентрации.

Рис. E2.1. Схематическое представление реальной пространственной структуры (слева) и соответствующей интенсивности волн в обратном пространстве (справа): (а) раствор не идентичных макромолекул, описываемый распределениями плотности амплитуды рассеяния ρ₁(r), ρ₂(r), ρ₃(r), и т.д.; (б) раствор идентичных не взаимодействующих макромолекул

Выражение для волны, рассеянной одиночной частицей, в зависимости от вектора рассеяния, Q:

где f_j и r_j – это, соответственно, амплитуда рассеяния и положение атома j. Интенсивность рассеянного излучения частицей – это квадрат амплитуды волны:

I (Q) = |F(Q)|²

При отсутствии взаимного влияния между разными частицами интенсивность рассеянного излучения от единицы объема раствора, содержащего N частиц, дается простым суммированием интенсивностей волн, рассеянных различными частицами (Рис. Е2.1а):

(Е2.1)

В случае тождественных частиц (монодисперсных), они все еще отличаются друг от друга своими рассеивающими свойствами, поскольку принимают различную ориентацию, и мы можем записать (Рис. Е2.1б):

(Е2.2)

где скобки обозначают ориентационное усреднение по пространству (различные частицы имеют разные ориентации) и времени (каждая частица в каждый данный момент времени принимает различные ориентации).

Отметим, если оставить в стороне число N, то это будет равнозначно допущению, что во время эксперимента одна частица движется и принимает различные ориентации. Её движение можно полностью описать перемещением и вращением. Перемещение равнозначно изменению начала координат и не меняет расчета амплитуды, которая зависит от положения атомов относительно друг друга, а не относительно начала координат. Таким образом, на практике, уравнение. (Е2.1) учитывает N частиц в растворе и тот факт, что каждая частица движется. Тут требуется еще одно замечание: вследствие ориентационного усреднения Q не является вектором в I_N(Q).

Для расчета вращательного среднего по |F(Q)|² Дебай использовал классическое решение:

Два допущения в малоугловом рассеянии.

Для интерпретации кривой рассеяния одиночной частицей обычно делаются два допущения: 1) Раствор является монодисперсным − значит все частицы в растворе являются тождественными. 2) Раствор является бесконечно разбавленным − нет никакой взаимосвязи между положениями или ориентацией частиц в растворе.

Принцип суммирования амплитуд для общей интенсивности рассеяния объектом приводит к формуле Дебая для конденсированной системы хаотично ориентированных рассеивающих частиц:

(Е2.3)

где F_j(s) - усредненные амплитуды рассеяния от отдельных частиц. Второе слагаемое в этой формуле есть интерференционный член, рассеянием от формы образца мы здесь пренебрегаем, т.к. это рассеяние существенно только на сверхмалых, практически ненаблюдаемых углах.

Если, к тому же, частицы в системе одинаковы и концентрация их настолько мала, что можно пренебречь интерференционным членом (при больших расстояниях между частицами r_jk дробь в формуле стремится к нулю), форма кривой малоуглового рассеяния от такого образца совпадает с кривой рассеяния от одной частицы:

(Е2.4)

и, значит, можно ставить задачу определения ее структуры по экспериментальным данным.

Усредним теперь интенсивность рассеяния по телесному углу  в обратном пространстве (забудем пока, что мы собирались усреднять как раз в прямом пространстве), пользуясь основной формулой для нее:

(Е2.5)

В прямом пространстве обозначим как drd, где d - элемент телесного угла в пространстве структуры объекта. Пределы изменения телесного угла равны . Тогда:

Пусть d - элемент телесного угла в обратном пространстве. Так как ориентацию структуры при усреднении по  мы считаем фиксированной (d = const), то можно отделить часть, не зависящую от угла в обратном пространстве, и тогда (с учетом формулы Дебая) имеем:

Выражение в фигурных скобках есть не что иное, как формула усреднения функции Паттерсона по ориентациям в прямом пространстве. Это замечательный результат: мы получили, что усреднение интенсивности в обратном пространстве связано с усреднением в прямом пространстве. Усредненная функция Паттерсона называется корреляционной функцией (функцией корреляции):

(Е2.6)

По определению Порода (1948) и Вилсона (1949), (r) - это функция распределения усредненного по ориентациям объема в области пересечения объема. Такое определение вытекает из определения функции Паттерсона, как самосвертки функции рассеивающей плотности. Корреляционная функция, в отличие от автокорреляционной функции Паттерсона, есть усредненное значение произведения двух флуктуаций плотности в точках, разнесенных на расстояние r:

С учетом этих определений, можно записать две формулы, которые являются прямым и обратным синус-фурье-преобразованиями:

Здесь r²(r) = p(r) – функция распределения по расстояниям. Полученные формулы примечательны еще и тем, что в них r и s теперь скаляры, а не векторы.

Выражение для автокорреляционной функции можно записать в виде:

где dV(r) есть число электронов в единице объема. При нулевом сдвиге 

,

где - усредненный по всему объему частицы квадрат рассеивающей плотности.

Отметим, что в объем частицы следует включать гидратационный слой или часть раствора, которая "потревожена" её присутствием. С точки зрения рассеяния объем частицы определяется на всем протяжении до границы, за которой растворитель ведет себя как однородный.