25.3 Рекомбінація днк

Перебудова ґенетичної інформації всередині молекули ДНК, або між молекулами, включає різноманітні процеси, що носять спільну назву «ґенетична рекомбінація». На даний час досліджується практичне застосування перебудов ДНК з метою зміни ґеномів багатьох організмів (Розділ 9).

Події, що відбуваються під час ґенетичної рекомбінації, можна згрупувати щонайменше у три великі класи. Гомологічна ґенетична рекомбінація (або загальна рекомбінація) включає обмін ґенетичним матеріалом між двома молекулами ДНК (чи сеґментами однієї молекули), які містять досить довгу ділянку майже ідентичної послідовності. Нуклеотидний склад послідовності, якщо вона подібна в обох молекулах ДНК, значення не має. Сайт-специфічна рекомбінація відрізняється від гомологічної рекомбінації тим, що обміни відбуваються лише у певній послідовності ДНК. ДНК-транспозиція відрізняється від обох попередніх класів генетичної рекомбінації і полягає у здатності коротких сеґментів ДНК переміщатися з одного місця хромосоми в інше. Такі “стрибаючі ґени” вперше було виявлено у 1940-х рр. Барбарою МакКлінток у кукурудзи. Окрім того, існує широкий спектр рідкісних ґенетичних перебудов, призначення і механізм дії яких ще не з’ясовано. У цьому підрозділі ми детально охарактеризуємо лише три навідені вище класи перебудов.

Барбара МакКлінток 1902-1992 (фото)

Функції систем ґенетичної рекомбінації такі ж різноманітні, як і їхні механізми. До них належать роль у спеціалізованих системах репарації і реплікації ДНК, реґуляція експресії певних ґенів, забезпечення правильного розходження хромосом під час поділу еукаріотичних клітин, підтримання ґенетичної різноманітності і здійснення запроґрамованих ґенетичних перебудов під час розвитку ембріона. У більшості випадків ґенетична рекомбінація тісно інтегрується з іншими процесами метаболізму ДНК, що і буде темою нашого подальшого розгляду.

Гомологічна ґенетична рекомбінація виконує декілька функцій

У бактерій гомологічна ґенетична рекомбінація спостерігається переважно під час процесу репарації ДНК і в цьому контексті (як відзначено у підрозділі 25.2) її відносять до рекомбінативної репарації ДНК. Як правило, її функція полягає у відновленні реплікативної вилки, яка зупинилася у місці ушкодження ДНК. Гомологічна ґенетична рекомбінація відбувається також під час процесу кон'югації (спарювання), коли хромосомна ДНК переноситься від бактерії-донора до бактерії-реципієнта. Рекомбінація під час кон'югації сприяє ґенетичній різноманітності, хоча в диких популяціях бактерій вона відбувається досить рідко.

В еукаріотів гомологічна ґенетична рекомбінація виконує декілька функцій у процесах реплікації та поділу клітин, зокрема забезпечує відновлення зруйнованих реплікативних вилок. Найчастіше рекомбінація виникає під час мейозу, коли диплоїдні клітини зародкової лінії з двома наборами хромосом внаслідок поділу утворюють гаплоїдні ґамети, у вищих еукаріотів – це сперматозоїди або яйцеклітини; ґамета містить лише одну із кожної пари хромосом (рис. 25-29). Мейоз розпочинається з реплікації ДНК в клітині зародкової лінії, тому кожна молекула ДНК присутня у чотирьох копіях. Далі відбуваються два послідовні цикли поділу клітини без повторного процесу реплікації ДНК, внаслідок чого вміст ДНК у кожній ґаметі зменшується до гаплоїдного рівня.

Після реплікації ДНК упродовж профази першого мейотичного поділу утворені сестринські хроматиди залишаються зв'язаними своїми центомерами. На цій стадії кожен набір із чотирьох гомологічних хромосом існує у вигляді двох пар хроматид. Обмін ґенетичною інформацією між тісно з’єднаними гомологічними хроматидами відбувається шляхом гомологічної ґенетичної рекомбінації, механізм якої полягає у розриві і повторному з”єднанні ДНК (Рис.25-30). Такий обмін генетичним матеріалом можна спостерігати за допомогою світлового мікроскопа, а оскільки відбувається він хрест-навхрест, то його називають кросинговером (від англ. crossing over – перехрещування),. Кросинговер з”єднує дві пари сестринських хроматид у точках, що називаються хіазмами (в однині - хіазма).

Кросинговер фактично об’єднує разом всі чотири гомологічні хроматиди, що важливо для точного розходження хромосом під час наступних мейотичних поділів клітини. Він не є цілком випадковим процесом, відповідні “гарячі точки” було виявлено у численних еукаріотичних хромосомах. Однак у багатьох випадках справедливим залишається припущення про те, що кросинговер може відбуватися з однаковою ймовірністю майже у будь-якій точці по довжині обох гомологічних хромосом, і це припущення уможливило складання ґенетичних карт. Частота гомологічних рекомбінацій в будь-якій ділянці, яка розділяє дві точки на хромосомі, приблизно пропорційна відстані між цими точками, що дозволяє визначати відносне положення і відстань між різними ґенами.

Отже, гомологічна рекомбінація виконує принаймні три уже встановлені функції: (1) задіяна у репарації декількох типів ушкоджень ДНК; (2) в еукаріотичних клітинах забезпечує тимчасовий фізичний контакт між хроматидами, що сприяє впорядкованому розходженню хромосом під час першого мейотичного поділу клітин; і (3) підвищує ґенетичну різноманітність популяції.

Процес рекомбінації під час мейозу починається з розриву у подвійному ланцюзі ДНК.

Ймовірна схема ґенетичної рекомбінації під час мейозу зображена на рисунку 25-31а. Модель включає чотири головні стадії: (1) гомологічні хромосоми розташовуються паралельно одна відносно іншої; (2) розрив подвійного ланцюга молекули ДНК розширюється екзонуклеазою таким чином, що утворюються одноланцюгові виступи з вільною 3’-гідроксильною групою на розірваному кінці (етап ); (3) виступаючі 3’-кінці проникають в інтактний дуплекс ДНК, після чого відбувається міграція «гілки» (Рисунок 25-32) і/або реплікація, що веде до виникнення пари перехресних структур, які називають з’єднаннями Голлідея (Рис. 25-31а, етапи -); (4) внаслідок розщеплення цих двох перехресних структур виникає два завершених рекомбінантних продукти (етап ).

В описаній моделі репарації подвійноланцюгового розриву у процесі рекомбінації для ініціації ґенетичного обміну використовуються 3’-кінці. Зразу ж після спаровування з комплементарним ланцюгом у складі інтактного гомолога утворюється ділянка гібридної ДНК, що містить комплементарні ланцюги двох батьківських ДНК (продукт етапу 2 на Рис.25-31а). Кожен з 3’-кінців тепер може слугувати праймером для реплікації ДНК. Сформована таким способом структура носить назву проміжної структури Голлідея (Рис. 25-31б) і є характерною особливістю процесу гомологічної ґенетичної рекомбінації у всіх організмів.

В окремих видів процес гомологічної рекомбінації може відрізнятися за багатьма деталями, однак більшість описаних вище етапів загалом наявні у них утій чи іншій формі. Для того, щоб лінійне розташування ґенів в обох рекомбінантних продуктах було таким же, як у субстратах, тобто у вихідних, нерекомбінованих хромосомах, існує два шляхи розщеплення, або «роз”єднання», проміжної структури Голлідея (етап  на Рис. 25-31а). Якщо розщеплення відбувається за одним із них, то фланкуюча (обмежувальна) ділянка ДНК, що містить гібрид ДНК, залишиться нерекомбінованою; у разі розщеплення іншим шляхом ця ділянка ДНК зазнає рекомбінації. Продукти обох описаних шляхів виявлено в умовах in vivo як в еукаріотів, так і у прокаріотів.

Гомологічна рекомбінація, проілюстрована на рисунку 25-31, - це дуже складний процес, наслідком якого є тонкі молекулярні зміни, що стають підґрунтям для виникнення ґенетичної різноманітності. Щоб зрозуміти, як це відбувається, необхідно пам’ятати, що дві гомологічні хромосоми, які беруть участь у рекомбінації, не обов”язково повинні бути ідентичними. Лінійне розташування ґенів може бути однаковим, але послідовність основ у деяких ґенах може дещо відрізнятися (у різних алелях). Наприклад, у людини одна хромосома може містити алель гемоглобіну А (нормального гемоглобіну), у той час як інша - алель гемоглобіну S (серповидноклітинна мутація), причому ця різниця може стосуватися лише однієї пари серед мільйонів пар основ. Гомологічна рекомбінація не змінює лінійного розташування ґенів, але може визначати, які алелі зв”язуватимуться разом в одній хромосомі.

Для рекомбінації необхідні ензими та інші протеїни клітини-хазяїна

З клітин прокаріотів та еукаріотів виділено ензими, здатні прискорювати різні етапи процесу гомологічної рекомбінації. Наприклад, у клітинах E.сoli ґени recB, recC і recD кодують ензим RecBCD, якому властиві і геліказна, і нуклеазна активності. Протеїн RecA прискорює усі головні етапи процесу гомологічної рекомбінації: спаровування двох ДНК, формування проміжних структур Голлідея і міґрацію гілки (описано нижче). Протеїни RuvA та RuvB (від англ. repair of UV damage – репарація ушкоджень ультрафіолетом) утворюють комплекс, який зв”язується з проміжними структурами Голлідея, заміщає протеїн RecA і у більшій мірі, ніж цей протеїн, прискорює міґрацію гілок ДНК. Із бактерій та дріжджів виділено нуклеази, здатні специфічно розщеплювати проміжні структури Голлідея, їх часто ще називають резольвазами. Протеїн RuvC є одним з принаймні двох таких нуклеаз, властивих клітинам E.coli.

Ензим RecBCD зв”язується з вільним (внаслідок розриву) кінцем лінійної ДНК і рухається вздовж подвійної спіралі до її середини, водночас розплітаючи і деградуючи ДНК у реакції, спряженій з гідролізом ATP (Рис.25-33). Активність ензиму змінюється у разі його зустрічі та взаємодії з послідовністю (5’)GCTGGTGG, що носить назву chi. З цієї точки швидкість деградації ланцюга з 3’-кінця значною мірою сповільнюється, а з 5’-кінця, навпаки, посилюється. Унаслідок цього утворюється одноланцюгова ДНК із 3’-кінцем, який використовується на наступних етапах рекомбінації (Рис.25-31). У різних ділянках ґеному E.сolі розкидано 1009 chi-послідовностей, завдяки чому частота рекомбінації у місцях їхнього розташування підвищується у 5-10 разів на 1000 п.о. По мірі віддалення від цих ділянок рівень такого підвищення зменшується. Послідовності, що підвищують частоту рекомбінацій, ідентифіковано також у декількох інших організмів.

Відмінність RecA від інших протеїнів, що беруть участь у метаболізмі ДНК, полягає в тому, що його активна форма - це упорядкований, спіральний філамент, складений із декількох тисяч мономерів, які збираються разом на молекулі ДНК (Рис.25-34). Такий філамент в нормі формується на одноланцюговій ДНК, що утворюється внаслідок дії ензиму RecBCD. Філамент може також формуватися на дуплексній ДНК, яка містить розрив в одному ланцюзі; у цьому випадку перші мономери RecA зв”язуються з одноланцюговою ДНК у ділянці розриву, після якого філамент, що збирається, швидко огортає сусідній дуплекс. Процеси збирання і розбирання філаментів RecA реґулюють протеїни RecF, RecO та RecR

Зручною моделлю для ілюстрації рекомбінативної активності філамента RecA є реакція обміну ланцюгом ДНК in vitro (Рис.25-35). Спочатку RecA зв'язується з одним ланцюгом ДНК, що започатковує нуклеопротеїновий філамент. Після цього RecA-філамент «підтягує» гомологічний дуплекс ДНК і розташовує його паралельно до зв”язаного ланцюга. Ланцюги двох ДНК обмінюються і утворюється гібридна ДНК. Обмін відбувається зі швидкістю 6 п.о./с в напрямку 5’3’ стосовно одноланцюгової ДНК з філаментом RecA. У такій реакції можуть брати участь три або чотири ланцюги ДНК (Рис.25-35); в останньому випадку під час реакції формується проміжна структура Голлідея.

Після включення дуплексу ДНК всередину RecA-філамента і вирівнювання його із зв’язаною одноланцюговою ДНК впродовж ділянок, що складаються із сотень пар основ, одна з ниток дуплексу змінює парних партнерів (Рис.25-36, етап ). Оскільки ДНК має спіральну структуру, то безперервний обмін ланцюга потребує упорядкованого обертання двох паралельних ДНК. Це викликає процес перемотування (етапи  і ), внаслідок чого точка розгалуження пересувається вздовж спіралі. Під час цієї реакції протеїн RecA гідролізує ATP.

Після утворення проміжної структури Голлідея для завершення рекомбінації використовується низка ензимів клітини-хазяїна - топоізомерази, протеїн RuvAB, що прискорює міґрацію гілки ДНК, резольваза, інші нуклеази, ДНК-полімераза I чи III та ДНК-ліґаза. Протеїн RucC клітин E. сoli (М_r 20 000) розщеплює структури Голлідея, внаслідок чого утворюються нерозгалужені хромосомні продукти нормальної довжини.

У процесі репарації зупинених реплікативних вилок задіяні всі аспекти метаболізму ДНК.

Навіть за умов нормального росту рівень ушкодження ДНК у клітинах бактерій, та зрештою як і у клітинах всіх інших організмів, досить високий. Більшість із них швидко виправляються шляхом вирізання основ, нуклеотидів або іншими описаними вище способами. І все ж майже кожна реплікативна вилка у бактерій по мірі руху від точки початку реплікації до її завершення наштовхується на нерепароване ушкодження ДНК чи розрив у якомусь місці ланцюга (Рис. 25-28). У випадку численних типів ушкоджень ензим ДНК-полімераза III не здатний продовжувати реплікацію, внаслідок чого на їх місці в одному ланцюзі ДНК залишається прогалина. Якщо ж на шляху трапляється розрив в одному ланцюзі, то виникає подвійноланцюговий розрив. В обох випадках необхідна рекомбінативна репарація ДНК (Рис. 25-37). За умов нормального росту зупинені реплікативні вилки реактивуються за допомогою складного репараративного шляху, що включає рекомбінативну репарацію ДНК, відновлення реплікації та репарацію будь-яких ушкоджень, що залишились після реплікації. У цих реакціях задіяні всі аспекти метаболізму ДНК.

Після зупинки реплікативної вилки її рух може відновитися принаймні двома головними шляхами, в яких задіяний протеїн RecA. Шлях репарації пошкоджень ДНК у вигляді прогалин потребує також участі протеїнів RecF, RecO та RecR, а репарація подвійноланцюгових розривів – ензиму RecBCD (Рис.25-37). Додаткові етапи рекомбінації характерні для процесу, що носить назву відновлення реплікації, незалежно від точки її початку, у ході якого відновлення реплікативної вилки відбувається за допомогою комплексу із сімох протеїнів (PriA, B, C та DnaB, C, G і T). Такий комплекс було відкрито як компонент, необхідний для реплікації ДНК X174 in vitro, тепер його називають праймосомою, що відновлює реплікацію. Новий старт реплікативної вилки також потребує участі ДНК-полімерази II, але роль її в даному процесі ще не з’ясовано; відомо, що активність полімерази ІІ важлива для завершення реплікації хромосоми ДНК-полімеразою III.

Процес репарації зупинених реплікативних вилок включає скоординований перехід від реплікації до рекомбінації і знову до реплікації. Етапи рекомбінації необхідні для заповнення прогалин у ДНК чи з”єднання розірваної гілки ДНК для відновлення розгалуженої структури ДНК у ділянці реплікативної вилки. Пошкодження, що залишаються після реплікації вже у дуплексній ДНК, репаруються шляхом вирізання основ чи нуклеотидів. Отже, у процесі репарації зупиненої реплікативної вилки бере участь широкий спектр ензимів, які охоплюють всі аспекти метаболізму ДНК. Очевидно, що цей тип процесу репарації є головною функцією системи гомологічної рекомбінації у кожній клітині, а дефекти у рекомбінативній репарації ДНК відіграють важливу роль у спричиненні хвороб людини (Додаток 25-1).

Наслідком сайт-специфічної рекомбінації є точні перебудови структури ДНК.

У процесі гомологічної ґенетичної рекомбінації можуть брати участь будь-які дві гомологічні послідовності, натомість у випадку сайт–специфічної рекомбінації – лише певні послідовності. У цьому полягає суттєва різниця між двома загальними типами рекомбінації. Реакції сайт–специфічної рекомбінації відбуваються практично у кожній клітині, однак їхні специфічні функції можуть дуже відрізнятися залежно від виду орґанізму. Прикладами таких функцій є реґуляція експресії певних ґенів і прискорення запроґрамованих перебудов ДНК упродовж розвитку ембріона чи в циклах реплікації деяких вірусних та плазмідних ДНК. Кожна система сайт-специфічної рекомбінації складається з ензиму рекомбінази і короткої (від 20 до 200 п.о.) специфічної послідовності ДНК, де і відбувається дія рекомбінази (так званий сайт рекомбінації). Час та хід реакції можуть реґулювати один чи більше допоміжних протеїнів.

Дослідження багатьох систем сайт-специфічної рекомбінації в умовах in vitro виявили деякі загальні принципи, у тому числі і основний хід реакції (Рис. 25-38а). Окремі рекомбінази розпізнають і зв”язуються з кожним із двох сайтів рекомбінації, розташованих у двох різних молекулах ДНК, чи в одній і тій же молекулі. Один ланцюгДНК розщеплюється у специфічній точці кожного сайту, а рекомбіназа ковалентно зв”язується з ДНК у сайті розщеплення через фосфотирозиновий (чи фосфосериновий) зв’язок (етап ). Таке тимчасове зв’язування протеїну з ДНК запобігає втраті фосфодіефірного зв”язку при розщепленні ДНК, тому на наступних етапах високоенергетичні кофактори, наприклад ATP, не потрібні. Розділені ланцюги ДНК з’єднуються з новими партнерами і формують проміжну структуру Голлідея з новими фосфодіефірними зв”язками, які виникають за рахунок зв’язку протеїн-ДНК (етап ). Для завершення реакції процес повинен повторитися у іншій точці всередині кожного з двох сайтів рекомбінації (етапи  і ). У деяких системах обидва ланцюги кожного сайту рекомбінації розрізаються одночасно і з’єднуються з новими партнерами без утворення проміжної структури Голлідея. Обмін ланцюгами ДНК завжди точний і взаємний (реципрокний), внаслідок чого після завершення реакції сайти рекомбінації відновлюються. Ензим рекомбіназу можна розглядати водночас і як сайт-специфічну ендонуклеазу, і як ліґазу.

Послідовності нуклеотидів у сайтах рекомбінації, які розпізнають сайт-специфічні рекомбінази, частково асиметричні (непаліндромні), а під час протікання рекомбіназної реакції обидва сайти розташовуються паралельно і орієнтуються однаково. Від розміщення та орієнтації сайтів рекомбінації залежить результат реакції (Рисунок 25-39). Якщо два сайти розташовані в одній і тій же молекулі ДНК, то внаслідок реакції відбувається або інверсія нової ділянки ДНК , або ж її делеція, що визначається, відповідно, протилежною чи однаковою орієнтацією сайтів. У випадку локалізації сайтів у різних молекулах ДНК відбувається міжмолекулярна рекомбінація; якщо ж одна або обидві молекули ДНК мають кільцеву структуру, то результатом реакції буде інсерція. Деякі рекомбіназні системи високоспецифічні лише до одного із цих типів реакції і діють виключно на сайти, що мають певну орієнтацію.

Першою сайт-специфічною рекомбінативною системою, яку дослідили в умовах in vitro, була система, що кодується бактеріофаґом . У разі проникнення ДНК фаґа  у клітини E. сoli відбувається низка складних реґуляторних процесів, залежно від яких подальший метаболізм молекули ДНК може протікати двома шляхами: -ДНК може або реплікуватися і ґенерувати ще більше бактеріофаґів (руйнуючи клітину-хазяїна), або інтеґруватися у хромосому хазяїна і пасивно реплікуватися у її складі впродовж багатьох наступних поколінь. Процес інтеграції здійснює кодована фаґом рекомбіназа (-інтеґраза), яка діє у сайтах рекомбінації фаґової і бактеріальної ДНК, а саме у сайтах приєднання attP і attB, відповідно (Рисунок 25-40). Роль сайт-специфічної рекомбінації у реґуляції експресії ґенів розглянуто у розділі 28.

Завершення реплікації хромосоми може потребувати сайт-специфічної рекомбінації

Незважаючи на важливість процесу рекомбінативної репарації ДНК для функціонування бактеріальних кільцевих хромосом, інколи він призводить до утворення шкідливих побічних продуктів. Після розщеплення з’єднання Голлідея у реплікативній вилці нуклеазою RuvC і завершення реплікації може утворитися два продукти: або звичайні дві мономерні хромосоми, або з’єднана димерна хромосома (Рисунок 25-41). В останньому випадку ковалентно зв’язані хромосоми не можуть розійтися до дочірніх клітин, внаслідок чого процес поділу материнської клітини зупиняється. Тоді спеціалізована сайт-специфічна рекомбінативна система, яка існує у клітинах E. сoli і має назву система XerCD, перетворює димерні хромосоми у мономерні, після чого процес поділу продовжується. Отже, дана реакція є реакцією сайт-специфічної делеції (Рисунок 25-39б) і слугує ще одним прикладом тісної координації між процесами рекомбінації ДНК та іншими аспектами її метаболізму.

Певні генетичні елементи здатні переміщатися з одного місця на інше

Тепер розглянемо третій загальний тип рекомбінативних систем, а саме рекомбінацію, яка забезпечує переміщення певних генетичних елементів, або транспозонів. Такі здатні до транспозиції сеґменти ДНК виявлено практично у всіх клітинах, вони можуть переміщатися, чи “стрибати”, з одного місця хромосоми (ділянки чи сайту-донора) на інше місце тієї ж або іншої хромосоми (на ділянку-мішень). Для такого переміщення, яке називають транспозицією, зазвичай не потрібна гомологія послідовності ДНК, оскільки нове місце локалізації сегмента визначається більшою чи меншою мірою випадково. Інсерція транспозону у важливий для функціонування клітини ген може призвести до її загибелі, тому процес транспозиції перебуває під чітким контролем і у нормі відбувається дуже рідко. Можливо, транспозони - це найпростіші молекулярні паразити, які адаптувалися до пасивної реплікації у складі хромосом клітини-хазяїна. У деяких випадках вони переносять гени, корисні для клітини, а, отже, перебувають у певних симбіотичних стосунках з хазяїном.

У клітинах бактерій існують два класи транспозонів. Інсерційні послідовності (прості транспозони) містять лише послідовності, необхідні для транспозиції, і ґени, що кодують протеїни (транспозази), які прискорюють цей процес. Складні транспозони, окрім цього, містять ще один чи більше генів, здатних, наприклад, нести стійкість до антибіотиків і завдяки цьому підвищувати шанси на виживання клітини-хазяїна. Отже, процес транспозиції частково опосередковує розповсюдження у популяціях хвороботворних бактерій елементів, які несуть стійкість до антибіотиків, внаслідок чого дія деяких із них стає неефективною (стр. ).

Бактеріальні транспозони мають різноманітну будову, але у більшості з них на кожному кінці наявні короткі повторювані послідовності, що слугують центрами зв’язування транспозаз. Під час транспозиції короткі послідовності (5-10 п.о.), що входять до складу сайту-мішені, дуплікуються і формують додаткову коротку повторювану послідовність, яка фланкує кожен кінець вставленого транспозону (Рисунок 25-42). Утворення таких дуплікованих сеґментів відбувається завдяки функціонуванню механізму розрізання, який використовується для інсерції транспозона в нове місце локалізації на ДНК.

У клітинах бактерій виявлено два основні шляхи транспозиції. У випадку прямої, чи простої транспозиції (Рис.25-43, зліва), транспозон вирізається з обох сторін і переміщається на нове місце локалізації, а у подвійноланцюговій молекулі донорної ДНК залишається розрив, який необхідно репарувати. У ділянці-мішені відповідний ензим робить зміщений розріз (як на рис. 25-42), у цей проміжок вставляється транспозон, після чого шляхом реплікації ДНК заповнюються проміжки і дуплікується послідовність ділянки-мішені. У випадку реплікативної транспозиції (Рис.25-43, справа) реплікується весь транспозон, залишаючи копію за місцем розташування донора. Проміжною структурою в цьому процесі виступає коінтеґрат, який складається з ділянки донора, ковалентно зв’язаної з ДНК ділянки-мішені. До складу коінтеґрату входять дві повні копії транспозону, які мають однакову відносну орієнтацію в ДНК. У деяких добре вивчених транспозонах коінтеґративна проміжна структура перетворюється на продукти шляхом сайт-специфічної рекомбінації, під час якої спеціалізовані рекомбінази пришвидшують обов’язкову реакцію делеції.

Транспозони, за структурою подібні до бактеріальних, виявлено також і в еукаріотів, іноді подібні і механізми їхнього перенесення. Однак у інших випадках механізм транспозиції, ймовірно, включає утворення проміжної молекули РНК. Еволюція таких транспозонів переплітається з еволюцією деяких класів РНК-вірусів, що описано у наступному розділі.

Збирання генів імуноґлобуліну відбувається шляхом рекомбінації

Деякі перебудови ДНК є запрограмованою частиною процесу розвитку еукаріотичних орґанізмів. Одним із важливих прикладів - утворення повністю функціональних ґенів імуноґлобуліну з окремих генних сеґментів у ґеномах хребетних. Хоча ґеном людини містить всього ≈35 000 генів, однак завдяки процесу рекомбінації в організмі людини (як і інших ссавців) утворюються мільйони різноманітних імуноґлобулінів (антитіл), які відрізняються за специфікою зв’язування. Вивчення механізмів рекомбінації вказує на їх тісний взаємозв’язок з транспозицією ДНК і наводить на думку про те, що система ґенерування великої різноманітності антитіл могла виникнути за рахунок проникнення транспозонів у клітину на ранніх етапах еволюції.

Як виникає різноманітність антитіл проілюструємо на прикладі генів людини, що кодують протеїни класу імуноґлобулінів G (IgG). Імуноґлобуліни складаються з двох «важких» (тобто, довгих) і двох «легких» (коротких) поліпептидних ланцюгів (див. Рис.5-23). Кожен ланцюг має дві ділянки: одну мінливу, або варіабельну, ділянку, послідовність якої досить відмінна у різних імуноґлобулінах, та ділянку, послідовність якої залишається практично стабільною для певного класу імуноґлобулінів. Існують також дві відмінні родини легких ланцюгів – каппа і лямбда, - які дещо відрізняються послідовностями своїх стабільних ділянок. Для всіх трьох типів поліпептидних ланцюгів (важкий ланцюг і легкі ланцюги κаппа та лямбда) характерний подібний механізм виникнення різноманітності мінливих ділянок. Ґени, які кодують ці поліпептиди, розділені на сеґменти, а ґеном містить кластери численних версій кожного сеґмента. Унаслідок поєднання однієї версії кожного із сеґментів і утворюється функціональний ґен.

На Рисунку 25-44 зображено структуру ділянки ДНК, в якій закодовано легкі κаппа-ланцюги IgG людини і показано шлях формування зрілого ланцюга. У недиференційованих клітинах кодуюча інформація для цього поліпептиду розділена на три сеґменти. У V-сеґменті (від англ. variable – варіабельний, мінливий) закодовано перші 95 амінокислотних залишків варіабельної ділянки, в J-сеґменті (від англ. joining - з’єднувальний) - решта її 12 залишків, а сеґмент С (від англ. constant – постійний, стабільний) кодує стабільну ділянку. Ґеном містить ≈300 різних V-сеґментів, 4 різних J-сеґменти і один С-сеґмент.

У процесі диференції стовбурових клітин кісткового мозку у зрілі В-лімфоцити один V-сеґмент і один J-сегмент з’єднуються за допомогою специфічної рекомбінативної системи (Рис. 25-44). Під час такої запрограмованої делеції ДНК вся вставлена ДНК видаляється. Існує близько 300  4 = 1 200 можливих комбінацій сегментів V-J. Даний процес рекомбінації не настільки точний, як описана вище сайт-специфічна рекомбінація, тому можливі додаткові варіації послідовності у ділянці з’єднання V-J. Це підвищує загальну мінливість щонайменше у 2,5 рази, отже, клітини здатні генерувати близько 2,5  1 200 = 3 000 різних V-J комбінацій. Кінцеве об’єднання комплексу V-J з ділянкою С досягається шляхом реакції РНК-сплайсингу після транскрипції, що описано в розділі 26.

Рекомбінативний механізм з’єднання сеґментів V і J проілюстровано на Рисунку 25-45. За кожним сеґментом V, як і перед кожним сеґментом J, розміщені рекомбінативні сигнальні послідовності (RSS, від англ. recombination signal sequences). З ними зв’язуються протеїни RAG1 і RAG2 (від англ. recombination activating gene - гени, які активують рекомбінацію). Протеїни RAG каталізують формування подвійноланцюгового розриву між сигнальними послідовностями і сеґментами V (чи J), які підлягають з’єднанню. Після цього сеґменти V і J з‘єднуються один з одним за допомогою іншого комлексу протеїнів.

Подібним шляхом формуються гени важких ланцюгів і легких лямбда-ланцюгів. Важкі ланцюги мають більше генних сеґментів, ніж легкі, а можливість комбінаційних варіантів у них перевищує 5 000. Оскільки при утворенні імуноґлобуліну будь-який важкий ланцюг може з’єднуватися з будь-яким легким ланцюгом, то кожна людина має не менше 3 0005 000 = 1,510⁷ можливих типів IgG. Додаткова різноманітність може виникати і завдяки високій частоті мутацій у V-послідовностях під час диференціації В-лімфоцитів (механізм яких ще не встановлено). Хоча кожен із зрілих В-лімфоцитів утворює лише один тип антитіл, однак спектр генерування їх різними клітинами справді вражає.

Чи пов’язана еволюція імунної системи з транспозонами? Механізм виникнення подвійноланцюгових розривів у молекулі ДНК за участю протеїнів RAG1 і RAG2 дійсно дуже подібний до декількох етапів реакції транспозиції (Рис.25-45). Окрім того, структура послідовності вирізаної ділянки ДНК, що містить RSS, аналогічна структурі більшості транспозонів. В умовах in vitro RAG1 і RAG2 здатні асоціювати з видаленою ДНК і включати її, подібно до транспозонів, у iнші молекули ДНК (така реакція, можливо, дуже рідко відбувається у В-лімфоцитах). Хоча не можна стверджувати остаточно, але особливості функціонування системи перебудови імуноґлобулінових ґенів наводять на думку про існування попередника, в якого у процесі еволюції зникла різниця між хазяїном і паразитом.

Підсумок 25.3 Рекомбінація ДНК

• Перебудова послідовностей ДНК відбувається внаслідок реакцій рекомбінації; як правило, цей процес тісно скоординований з реакціями реплікації та репарації ДНК

• Гомологічна ґенетична рекомбінація може відбуватися між будь-якими двома молекулами ДНК, що містять гомологічну послідовність. Під час мейозу (у клітинах еукаріотів) такий тип рекомбінації забезпечує правильне розходження хромосом і виникнення ґенетичного різноманіття. У клітинах і бактерій, і еукаріотів цим шляхом відбувається репарація зупинених реплікативних вилок. Під час гомологічної рекомбінації формується проміжна структура Голлідея.

• Сайт-специфічна рекомбінація спостерігається лише у певних послідовностях ДНК і також може включати формування проміжної структури Голлідея. Рекомбінази розщеплюють ДНК у специфічних точках і з’єднують (лігують) ланцюги з новими ділянками ДНК. Такий тип рекомбінації виявлено практично у всіх клітинах, серед багатьох його функцій – участь у процесі інтеграції ДНК і регуляції експресії генів.

• Шляхом рекомбінації практично у всіх клітинах відбувається переміщення транспозонів як у межах однієї хромосоми, так і між хромосомами. У хребетних організмів шляхом запрограмованої реакції рекомбінації, подібної до реакції транспозиції, відбувається з’єднання ґенних сегментів і формування функціональних імуноґлобулінових ґенів під час диференціації В-лімфоцитів.

Основні терміни

Жирним шрифтом виділено терміни, визначення яких наведено у словнику

матриця

напівконсервативна реплікація

реплікативна вилка

точка початку реплікації

фраґменти Оказакі

ведучий ланцюг

відстаючий ланцюг

нуклеази

екзонуклеаза

ендонуклеаза

ДНК-полімераза I

праймер

кінець праймера

продуктивність

коригування

ДНК-полімераза III

реплісома

гелікази

топоізомерази

праймази

ДНК-ліґаза

праймосома

катенан

ДНК-полімераза α

ДНК-полімераза 

ДНК-полімераза 

мутація

репарація шляхом вирізання основ

ДНК ґлікозилази

АП-сайт

АП-ендонуклеази

ДНК-фотоліази

рекомбінативна репарація ДНК

синтез ДНК через ушкодження з пропуском помилок

SOS-відповідь

гомологічна ґенетична рекомбінація

сайт-специфічна рекомбінація

ДНК-транспозиція

мейоз

міґрація гілки ДНК

модель репарації розриву подвійного ланцюга

проміжна структура Голлідея

транспозони

транспозиція

інсерційна послідовність

коінтеґрат

Додаткова література

Загальні посилання

Friedberg, E.C., Walker, G.C., & Siede, W. (1995) DNA Repair and Mutagenesis, American Society for Microbiology, Washington, DC. A thorough treatment of DNA metabolism and a good place to start exploring this field.

Kornberg, A. & Baker, T.A. (1991) DNA Replication, 2nd edn, W. H. Freeman and Company, New York. Excellent primary source for all aspects of DNA metabolismи

Реплікація ДНК

Benkovic, S.J., Valentine, A.M., & Salinas, F. (2001) Replisome-mediated DNA replication. Annu. Rev. Biochem. 70, 181–208. This review describes the similar strategies and enzymes of

DNA replication in different classes of organisms.

Boye, E., Lobner-Olesen, A., & Skarstad, K. (2000) Limiting DNA replication to once and only once. EMBO Rep. 1, 479–483. Good summary of the mechanisms by which replication initiation is regulated.

Davey, M.J. & O’Donnell, M. (2000) Mechanisms of DNA replication. Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 581–586.

Ellison, V. & Stillman, B. (2001) Opening of the clamp: an intimate view of an ATP-driven biological machine. Cell 106, 655–660.

Frick, D.N. & Richardson, C.C. (2001) DNA primases. Annu. Rev. Biochem. 70, 39–80.

Hübscher, U., Maga, G., & Spadari, S. (2002) Eukaryotic DNA polymerases. Annu. Rev. Biochem. 71, 133–163. Good summary of the properties and roles of the more than one dozen known eukaryotic DNA polymerases.

Jeruzalmi, D., O’Donnell, M., & Kuriyan, J. (2002) Clamp loaders and sliding clamps. Curr. Opin. Struct. Biol. 12, 217–224. Summary of some of the elegant work elucidating how clamp

loaders function.

Kamada, K., Horiuchi, T., Ohsumi, K., Shimamoto, N., & Morikawa, K. (1996) Structure of a replication-terminator protein complexed with DNA. Nature 383, 598–603. The report revealing the structure of the Tus-Ter complex.

Katayama, T. (2001) Feedback controls restrain the initiation of Escherichia coli chromosomal replication. Mol. Microbiol. 41, 9–17.

Kool, E.T. (2002) Active site tightness and substrate fit in DNA replication. Annu. Rev. Biochem. 71, 191–219. Excellent summary of the molecular basis of replication fidelity

by a DNA polymerase—base-pair geometry as well as hydrogen bonding.

Lemon, K.P. & Grossman, A.D. (2001) The extrusion-capture model for chromosome partitioning in bacteria. Genes Dev. 15, 2031–2041. Report describing the replication factory model for bacterial DNA replication.

Nishitani, H. & Lygerou, Z. (2002) Control of DNA replication licensing in a cell cycle. Genes Cells 7, 523–534. A good summary of recent advances in the understanding of

how eukaryotic DNA replication is initiated.

Toyn, J.H., Toone, M.W., Morgan, B.A., & Johnston, L.H. (1995) The activation of DNA replication in yeast. Trends Biochem. Sci. 20, 70–73.

Репарація ДНК

Begley, T.J. & Samson, L.D. (2003) AlkB mystery solved: oxidative demethylation of N1-methyladenine and N3-methylcytosine adducts by a direct reversal mechanism. Trends Biochem. Sci. 28, 2–5.

Friedberg, E.C., Fischhaber, P.L., & Kisker, C. (2001) Errorprone DNA polymerases: novel structures and the benefits of infidelity. Cell 107, 9–12.

Goodman, M.F. (2002) Error-prone repair DNA polymerases in prokaryotes and eukaryotes. Annu. Rev. Biochem. 71, 17–50. Review of a class of DNA polymerases that continues to grow.

Kolodner, R.D. (1995) Mismatch repair: mechanisms and relationship to cancer susceptibility. Trends Biochem. Sci. 20, 397–401.

Lindahl, T. & Wood, R.D. (1999) Quality control by DNA repair. Science 286, 1897–1905.

Marnett, L.J. & Plastaras, J.P. (2001) Endogenous DNA damage and mutation. Trends Genet. 17, 214–221.

McCullough, A.K., Dodson, M.L., & Lloyd, R.S. (1999) Initiation of base excision repair: glycosylase mechanisms and structures. Annu. Rev. Biochem. 68, 255–286.

Modrich, P. & Lahue, R. (1996) Mismatch repair in replication fidelity, genetic recombination, and cancer biology. Annu. Rev. Biochem. 65, 101–133.

Sancar, A. (1996) DNA excision repair. Annu. Rev. Biochem. 65, 43–81.

Sutton, M.D., Smith, B.T., Godoy, V.G., & Walker, G.C. (2000) The SOS response: recent insights into umuDC-dependent mutagenesis and DNA damage tolerance. Annu. Rev. Genet. 34, 479–497.

Wood, R.D., Mitchell, M., Sgouros, J., & Lindahl T. (2001) Human DNA repair genes. Science 291, 1284–1289. Description of what an early look at the human genome reveals

about DNA repair.

Рекомбінація ДНК

Cox, M.M. (2001) Historical overview: searching for replication help in all of the rec places. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8173–8180. A review of how recombination was shown to be a replication fork repair process.

Craig, N.L. (1995) Unity in transposition reactions. Science 270, 253–254.

Eggleston, A.K. & West, S.C. (1996) Exchanging partners: recombination in E. coli. Trends Genet. 12, 20–26.

Gellert, M. (2002) V(D)J recombination: RAG proteins, repair factors, and regulation. Annu. Rev. Biochem. 71, 101–132.

Hallet, B. & Sherratt, D.J. (1997) Transposition and sitespecific recombination: adapting DNA cut-and-paste mechanisms to a variety of genetic rearrangements. FEMS Microbiol. Rev. 21, 157–178.

Kogoma, T. (1996) Recombination by replication. Cell 85, 625–627.

Lieber, M. (1996) Immunoglobulin diversity: rearranging by cutting and repairing. Curr. Biol. 6, 134–136.

Lusetti, S.L. & Cox, M.M. (2002) The bacterial RecA protein and the recombinational DNA repair of stalled replication forks. Annu. Rev. Biochem. 71, 71–100.

Marians, K.J. (2000) PriA-directed replication fork restart in Escherichia coli. Trends Biochem. Sci. 25, 185–189.

Pâques, F. & Haber, J.E. (1999) Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349–404.

Van Duyne, G.D. (2001) A structural view of Cre-loxP sitespecific recombination. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 30, 87–104.

Завдання

1. Висновки з експерименту Мезельсона-Сталя. Експеримент Мезельсона-Сталя (див. Рис.25-2) доказав, що реплікація ДНК у клітинах E. сoli відбувається напівконсервативним способом. Згідно «дисперсивної» моделі реплікації, ланцюги батьківської ДНК розщеплюються на фрагменти різних розмірів, а потім з’єднуються з фрагментами новосинтезованої молекули ДНК, утворюючи дочірні дуплекси. Якби реплікація ДНК відбувалася за такою моделлю, то в експерименті Мезельсона-Сталя кожний ланцюг мав би містити випадково розташовані сеґменти як «важкої», так і «легкої» ДНК. Поясніть, будь-ласка, чому результати експерименту Мезельсона-Сталя не вписуються у таку модель.

2. Дослідження реплікації ДНК з використанням важких ізотопів. Культуру бактерій E. сoli, яка росла на середовищі з ¹⁵NH₄Cl, перенесли на нове середовище з ¹⁴NH₄Cl і вирощували впродовж трьох ґенерацій (за цей час популяція збільшилася у вісім разів). Яким після цього буде молекулярне співвідношення гібридної ДНК (¹⁵N-¹⁴N) до легкої ДНК (¹⁴N-¹⁴N)?

3. Реплікація хромосоми E.сoli. Хромосома E. сoli містить 4 639 221 п.о.

(а) Скільки витків подвійної спіралі розплітається під час реплікації хромосоми E. сoli?

(б) Використовуючи дані, наведені у цьому розділі, обчисліть, скільки часу необхідно для реплікації хромосоми E. сoli за температури 37⁰С, якщо дві реплікативні вилки переміщатимуться з точки початку реплікації? Вважайте, що реплікація відбувається зі швидкістю 1 000 п.о./с. За певних умов клітини E. сoli здатні до поділу через кожні 20 хв. Поясніть, як це може відбуватися?

(в) Скільки фрагментів Оказакі формується під час реплікації хромосоми E. сoli? Які фактори забезпечують з’єднання у правильному порядку численних фрагментів Оказакі у новій ДНК?

4. Склад основ у молекулах ДНК, синтезованих на одноланцюгових матрицях. Спрогнозуйте склад основ ДНК, синтезованих ДНК-полімеразою на матрицях, що утворюються у випадку еквімолярної суміші двох комплементарних ланцюгів ДНК бактеріофага X174 (кільцева молекула ДНК). Склад основ одного ланцюга: А - 24.7%; G – 24.1%; C – 18.5%; Т – 32.7%. Яке припущення необхідно зробити для відповіді на це завдання?

5. Реплікація ДНК. Корнберг зі співробітниками проінкубували розчинний екстракт E.сoli із сумішшю дATP, дТТP, дGТP і дCТP, кожен з яких був помічений ³²Р в -фосфатній групі. Згодом інкубаційну суміш обробили трихлороцтовою кислотою, яка осаджує ДНК, але не осаджує нуклеотидні попередники. Осад зібрали і за його радіоактивністю визначили рівень включення попередників в ДНК.

(а) Чи буде радіоактивним осад за умови видалення зі складу інкубаційної суміші будь-якого з чотирьох нуклеотидних попередників? Поясніть.

(б) Чи включиться ³²Р в ДНК у випадку, якщо міченим буде лише дТТP? Поясніть.

(с) Чи буде радіоактивним осад у випадку, якщо поміченим ³²Р буде не -фосфат, а - або -фосфат дезоксирибонуклеотиду? Поясніть.

6. Ведучий і відстаюий ланцюги ДНК. Приготуйте таблицю з переліком назв і порівняйте функції попередників, ензимів та інших протеїнів, необхідних для синтезу ведучого і відстаюого ланцюгівДНК під час реплікації у клітинах E. сoli.

7. Функції ДНК-ліґази. Деякі мутанти E. сoli містять дефективну ДНК-ліґазу. Якщо такі мутанти проінкубувати з міченим ³Н-тиміном, а синтезовану ДНК розділити у лужному градієнті щільності сахарози, то отримаємо дві радіоактивні смуги. Одна з них відповідає фракції з високою молекулярною вагою, а друга - фракції з низькою молекулярною вагою. Поясніть експеримент.

8. Точність реплікації ДНК. Які фактори забезпечують точність реплікації під час синтезу ведучого ланцюга ДНК? Чи можна очікувати такої ж точності синтезу відстаючого ланцюга? Поясніть свою відповідь.

9. Важливість топоізомераз для реплікації ДНК. Процес розплітання ДНК, який відбувається під час реплікації, впливає на щільність надспіралі ДНК. Якби не було топоізомераз, то ділянка ДНК перед реплікативною вилкою ставала б перекрученою, а позаду неї - недокрученою. У клітинах бактерій реплікативна вилка зупиняється, коли щільність надспіралі ДНК () попереду вилки досягає величини +0.14 (див. Розділ 24).

В умовах in vitro за відсутності топоізомераз двонаправлена реплікація ініціюється в точці початку реплікації плазміди завдовжки 6 000 п.о. Початкова величина  плазміди дорівнює -0.06. Скільки пар основ буде розплетено і репліковано кожною вилкою до моменту її зупинки? Вважайте, що обидві вилки рухаються з однаковою швидкістю і мають всі необхідні для елонгації компоненти, окрім топоізомерази.

10. Тест Еймса. Тонкий шар аґару, що містить ~ 10⁹ клітин гістидинових ауксотрофів Salmonella phimurium (мутантних клітин, для виживання яких необхідний гістидин), на поживному середовищі без гістидину утворює ~13 колоній упродовж дводенного інкубаційного періоду за температури 37⁰С (див. Рис. 25-19). Як виникають ці колонії за відсутності гістидину? При повторенні експерименту за наявності у середовищі 0,4 мкг 2-аміноантрацену кількість колоній, які виникають протягом двох днів, перевищує 10 000. На які властивості 2-аміноантрацену вказують ці факти? Які висновки можна зробити щодо його канцерогенності?

11. Механізми репарації ДНК. У клітинах хребетних і рослин часто відбувається метилювання цитозину у складі ДНК і утворення 5-метилцитозину (див.Рис.8-5а). У цих же клітинах спеціалізована система репарації розпізнає некомплементарне спаровування основ G-Т і виправляє їх на G≡C. Яких переваг надає клітині така система репарації? (Поясніть з точки зору наявності 5-метилцитозину у складі ДНК).

12. Репарація ДНК у людей із хворобою Xeroderma Pigmentosum. Захворювання, відоме під назвою Xeroderma Pigmentosum (XP), виникає внаслідок мутацій принаймні у семи різних ґенах людини. Ці дефекти переважно стосуються ґенів, що кодують ензими, задіяні на певних етапах шляху репарації вирізанням нуклеотидів. Різні типи XP позначають літерами від А до G (XPA, XPB і т.д.) з декількома додатковими варіантами, які позначають абревіатурою XPV.

Культури клітин, взятих у здорових людей і у пацієнтів з XPG, опромінювали ультрафіолетом. Після виділення і денатурації ДНК, отриману одноланцюгову ДНК характеризували методом аналітичного ультрацентрифугування.

(а) У препаратах, виділених із нормальних фібробластів, спостерігали значне зменшення середньої молекулярної ваги одноланцюгової ДНК після опромінення, однак у препаратах з XPG-фібробластів його не виявлено. Чому?

(б) Який етап може бути дефектним у фібробластах пацієнтів, хворих на XPG, якщо припустити, що система репарації шляхом вирізання нуклеотидів у них функціонує? Поясніть.

13. Проміжна структура Голлідея. Чим відрізняється формування проміжних структур Голлідея у разі гомологічної генетичної рекомбінації та сайт-специфічної рекомбінації?

РИСУНОК 25-1 Карта хромосоми E.сoli. На карті вказано відносне розташування ґенів, що кодують численні протеїни, важливі для метаболізму ДНК. Значна кількість залучених ґенів свідчить про складність метаболічих процесів. Числа від 0 до 100 всередині кільцевої хромосоми - загальноприйняте у ґенетиці позначення, яке називають хвилинами. Кожна хвилина відповідає 40 000 п.о. розташованих уздовж молекули ДНК E. сoli. Трилітерні позначення ґенів та інших елементів, як правило, відображають деякі аспекти їхніх функцій. Наприклад, mut – мутаґенез (від mutagenesis); dna – реплікація ДНК; pol – ДНК-полімераза (від DNA polymerase); rpo – РНК-полімераза (від RNA-polymerase); uvr - УФ-стійкість (від UV-resistance); rec – рекомбінація (від recombination); dam - метилювання аденіну у складі ДНК (від DNA adenine methylation); lig – ДНК-ліґаза (від DNA ligase); Ter – завершення реплікації (termination of replication) та ori – точка початку реплікації (від origin - початок).

Протеїн репарації помилок спаровування mutL

Протеїн, що зв”язується з одноланцюговою ДНК ssb

репарація ДНК uvrA

Геліказа dnaB

Субодиниці РНК-полімерази rpoB, rpoC

ДНК-полімераза I polA

ДНК-геліказа/ репарація помилок спаровування uvrD

mutU

dnaP

Геліказа 3’→5’ - rep

Точка початку реплікації (oriС)

Ініціація реплікації – dnaN dna A

рекомбінативна репарація– recF

Cубодиниця ДНК-ґірази - gyrB

Збирання праймосоми – priA

Метилювання – dam

Субодиниці РНК-полімерази – rpoA, rpoD

Праймаза - dnaG

Протеїни репарації помилок спаровування mutH, mutS

Рекомбінація і рекомбінативна репарація recC, recB, recD

Рекомбінація і рекомбінативна репарація recA

Урацилґлікозилаза ung

ДНК-лігаза– lig

Рекомбінативна репарація rec O

Субодиниця ДНК-ґірази gyrA

AП-ендонуклеаза nfo

Екзонуклеаза I sbcB

Репарація ДНК uvrC

Рекомбінація і рекомбінативна репарація ruvC, ruvA, ruvB

Cубодиниця ДНК-полімерази III holE

AП-ендонуклеаза xthA

Термінація реплікації Ter

О⁶G- алкилтрансфераза ogt

ДНК-полімераза V umuC umuD

Субодиниця ДНК-полімерази III holB

РепараціяДНК – uvrB

ДНК-фотоліаза – phr

Субодиниця ДНК-полімерази III – hol A

Рекомбінативна репарація recR

ДНК-полімераза IV dinB

Субодиниця ДНК-полімерази III dnaQ

Субодиниця ДНК-полімерази III dnaE

mutT

ДНК-полімераза II polB

dnaJ, dnaK

Компоненти праймосоми - dnaC

Субодиниця ДНК-полімерази III holD

Субодиниця ДНК-полімерази III holC

РИСУНОК 25-2 Експеримент Мезельсона-Сталя. (а) Багато поколінь клітин вирощували на середовищі, яке містило тільки важкий ізотоп азоту - ¹⁵N, тому у складі ДНК цих клітин був лише ¹⁵N. Після центрифуґування виділеного препарату ДНК у ґрадієнті густини СsCl отримали окрему смугу (блакитного кольору). (б) Клітини перенесли на середовище, яке містило лише легкий ізотоп азоту - ¹⁴N, і вирощували впродовж однієї генерації; ДНК, виділена із цих клітин, розташувалася у ґрадієнті трохи вище (смуга фіолетового кольору). (в) Після другої генерації за цих же умов з клітин виділили дві гібридні молекули ДНК і дві “легкі” молекули (червоного кольору), цим і було підтверджено напівконсервативний спосіб реплікації ДНК.

Екстраґована і відцентрифуґована у ґрадієнті густини CsCl ДНК «Важка» ДНК (¹⁵N); Вихідна батьківська молекула

Гібридна ДНК (¹⁵N-¹⁴N) Дочірні молекули після першої ґенерації

«Легка» ДНК (¹⁴N) Гібридна ДНК Дочірні молекули після другої ґенерації.

РИСУНОК 25-3 Візуалізація двонаправленої реплікації ДНК. Унаслідок реплікації кільцевої хромосоми утворюється структура, подібна на літеру тета () грецького алфавіту. (а) Експерименти з міченим тритієм (³Н) показали, що обидва ланцюги реплікуються одночасно (нові ланцюги позначено червоним кольором). Електронна мікрофотографія ілюструє процес реплікації кільцевої плазміди E. сoli, унаочнений за допомогою методу авторадіографії. (б) Шляхом додавання ³Н на короткий період часу якраз перед зупинкою реакції визначають напрямок реплікації: якщо мітку (позначено червоним кольором) виявляють в одній реплікативній вилці на авторадіограмі. то це означає, що реплікація відбувається в одному напрямку, якщо ж у двох – реплікація відбувається у двох напрямках. Завдяки цій методиці було виявлено, що у клітинах E. сoli, Bacillus subtilis та інших бактерій реплікація ДНК протікає у двох напрямках.

Двонаправлена Реплікативні вилки Точка початку реплікації Однонаправлена Точка початку реплікації

РИСУНОК 25-4 Визначення ланцюгів ДНК у реплікативній вилці. Новий ланцюг ДНК (червоного кольору) завжди синтезується у напрямку 5’3’. Матриця зчитується у протилежному напрямку, 3’5’. Ведучий ланцюг синтезується безперервно в напрямку руху реплікативної вилки. Другий ланцюг синтезується перервно у вигляді коротких відрізків (фраґментів Оказакі) у напрямку, протилежному до напрямку руху реплікативної вилки. Після синтезу фраґменти Оказакі з”єднуються ДНК-ліґазою. У бактерій фраґменти Оказакі мають довжину 1 000 - 2 000 нуклеотидів, а в еукаріотів - від 150 до 200 нуклеотидів.

Ведучий ланцюг Напрямок руху реплікативної вилки Фраґменти Оказакі Відстаючий ланцюг

РИСУНОК 25-5 Елонгація ланцюга ДНК. (а) Активність ДНК-полімерази І проявляється за наявності окремого неспарованого ланцюга, який слугує матрицею, і праймерного ланцюга, що містить вільну гідроксильну групу на 3’-кінці, до якої приєднується нова нуклеотидна одиниця. Кожен наступний нуклеотид відбирається шляхом спаровування основи з відповідним нуклеотидом у складі матричного ланцюга. Продукт реакції містить новий вільний 3’-гідроксил, до якого приєднується наступний нуклеотид. (б) Каталітичний механізм, ймовірно, включає участь двох Mg²⁺, які координаційно зв'язуються з фосфатними групами приєднуваного нуклеотидтрифосфату і трьома залишками Asp, два з яких висококонсервативні і містяться в усіх ДНК-полімеразах. Зображений на рисунку зверху іон Mg²⁺ сприяє атаці 3'-гідроксильної групи праймера на атом α-фосфату у складі нуклеотидтрифосфату; нижній іон Mg²⁺ полегшує витіснення пірофосфату. Обидва іони стабілізують структуру п'ятиковалентного перехідного стану. За подібним механізмом діють і РНК-полімеразми (див. Рис. 26-1б).  Полімеризація нуклеотидів ДНК-полімеразою

Приєднуваний дезоксинуклеозид-5'-трифосфат Нарощуваний ланцюгДНК (праймер) Матричний ланцюгДНК Матричний ланцюг–2 рази Дезоксирибоза ДНК-полімераза

РИСУНОК 25-6. Вплив ґеометрії пари основ на точність реплікації ДНК. (а) Стандартні пари основ А=Т та C=G мають дуже схожу ґеометрію, тому активний центр, пристосований до розміру однієї пари (затінено блакитним кольором), здатний розмістити й іншу пару. (б) Ґеометрія неправильно спарованих основ є причиною видалення їх з активного центру, що й відбувається у випадку ДНК-полімерази I.

РИСУНОК 25-7 Приклад коригування помилки завдяки 3’5’-екзонуклеазній активності ДНК-полімерази I. Структурний аналіз виявив, що у разі орієнтації ензиму у напрямку переміщення вздовж молекули ДНК, його екзонуклеазна активність проявляється раніше, ніж полімеразна активність. Помилкове спаровування основ (у даному випадку С-А) заважає транслокації ДНК-полімерази І в наступне положення. Ковзаючи у зворотному напрямку, ензим виправляє помилку завдяки своїй 3’5’-екзонуклеазній активності, після чого продовжує полімеризувати ДНК у напрямку 5’3’.

- ДНК-полімераза I Активний центр ДНК-полімерази Активний (коригувальний) центр 3’5’-екзонуклеази

С - рідкісна таутомерна форма цитозину (С*), яка здатна спаровуватися з А і включатися в ланцюгДНК, що синтезується

Перед переміщенням полімерази відбувається таутомерне зміщення цитозину від С* до С. Новий нуклеотид тепер не підходить цій основі.

- Неправильно спарований 3’-ОН – кінець синтезованого ланцюга блокує подальшу елонґацію. ДНК-полімераза ковзає назад і неправильно спарована основа потрапляє в 3’5’-екзонуклеазний активний центр.

Неправильно спарований нуклеотид видалено

ДНК-полімераза ковзає вперед і відновлює свою полімеризуючу активність.

Таблиця 25-1. Порівняння ДНК-полімераз E. coli
ДНК-полімерази . I II III .
Структурний ґен*	рolA	рolB	рolC (dnaE)
Субодиниці (кількість різних типів)	1	4	10
Мr	103 000	88 000†	791500
3’5’-екзонуклеаза (коригувальна)	Так	Так	Так
5’3’-екзонуклеаза	Так	Ні	Ні
Швидкість полімеризації (нуклеотидів/с)	16-20	40	250-1000
Продуктивність (кількість приєднаних нуклеотидів перед дисоціацією полімерази)	3-200	1500	500 000

^* Для ензимів, що мають більше однієї субодиниці, вказано ґен, який кодує субодиницю з полімеразною активністю. Зауважте, що dnaE – колишнє позначення ґена, який тепер позначають як polC.

^† Тільки полімеризуюча субодиниця. ДНК-полімераза II і ДНК-полімераза III мають декілька однакових субодиниць, а саме: , , , ’,  і  (див. Таблицю 25-2).

Таблиця 25-2. Субодиниці ДНК-полімерази III E.coli
Субодиниця	Число субодиниць на голоензим	Мr субодиниці	Ґен	Функція субодиниці
	2	129 900	polC (dnaE)	Полімеризуюча активність
	2	27 500	dnaQ (mutD)	3’5’-коригувальна екзонуклеаза
	2	8 600	hol E
	2	71 100	dnaX	Стабільне зв’язування з матрицею; димеризація осердя ензиму
	2	47 500	dnaX*	Завантаження фіксатора
	1	38 700	holA	Відкривання фіксатора
’	1	36 900	holB	Завантаження фіксатора
	1	16 600	holC	Взаємодія з SSB
	1	15 200	holD	Взаємодія з  та 
	4	40 600	dnaN	ДНК -фіксатор, необхідний для оптимальної продуктивності

* -субодиниця кодується частиною ґена, який кодує -субодиницю, так що 66% послідовності на амінокінці субодиниці  мають таку ж послідовність амінокислот, як і -субодиниця. Субодиниця  утворюється за допомогою механізму зміщення рамки трансляції (див. додаток 27-1), що призводить до передчасного завершення процесу трансляції.

Так мені прислали цю табл.. Прошу додати справа: Core polimerase - Осердя полімерази

 -Комплекс, який завантажує -субодиниці на відстаючий ланцюг при синтезі кожного фраґмента Оказакі

РИСУНОК 25-8 Великий фраґмент ДНК-полімерази I (фраґмент Кленова). Полімераза цього типу широко розповсюджена у бактерій. Фраґмент Кленова, який утворюється внаслідок протеолітичної обробки полімерази, зберігає полімеризуючу і коригувальну активності ензиму. Наведений тут фраґмент Кленова виділено з термофільної бактерії Bacillus stearothermophilus (PDB ID 3BDP). Активний центр для приєднання нуклеотидів захований глибоко в щілині на віддаленому кінці зв”язаної ДНК. Темно синім кольором позначено матричний ланцюг.

РИСУНОК 25-9. Нік-трансляція. У цьому процесі ланцюг ДНК чи РНК, комплементарно з’єднаний з ДНК-матрицею, одночасно деградує під дією 5’3’ - екзонуклеазної активності ДНК-полімерази І і заміщується завдяки полімеразній активності цього ж ензиму. Ці активності відіграють роль як у репарації ДНК, так і у видаленні праймерів РНК під час реплікації (обидва процеси описано нижче). Ланцюг ДНК чи РНК, що підлягає видаленню, позначено зеленим кольором, а ланцюг, що його заміщує, – червоним. Синтез ДНК починається у місці розриву ланцюга (розривається фосфодіефірний зв”язок і з'являються вільні 3’-гідроксил і 5’-фосфат). Полімераза I нарощує нематричний ланцюг ДНК і переміщує місце розриву (англ. nick) вздовж молекули ДНК. Цей процес називають нік-трансляцією. Розрив залишається і після дисоціації ДНК-полімерази I, а пізніше зшивається іншим ензимом.

Розрив РНК чи ДНК; Матричний ланцюг ДНК ДНК-полімераза I Розрив

РИСУНОК 25-10. ДНК-полімераза ІІІ. (а) Будова бактеріальної ДНК-полімерази ІІІ. Два домени осердя, що складаються з субодиниць α, ε і θ, з'єднані γ-комплексом (також відомим як «комплекс, що завантажує фіксатор»), який складається з п'яти субодиниць - τ₂’. Субодиниці γ і τ кодуються одним ґеном. Субодиниця γ - це укорочений варіант субодиниці τ; отже, субодиниця τ містить ідентичний домен з γ-субодиницею та додатковий сеґмент, який взаємодіє з осердям полімерази. З γ-комплексом зв'язуються також дві інші субодиниці ДНК-полімерази ІІІ^*, χ і ψ (не навідстаюо). З двома осердями утвореної структури взаємодіють два β- фіксатори, кожен з яких є димером β-субодиниці. Комплекс взаємодіє з геліказою DnaB через τ-субодиницю. (б) Дві -субодиниці ДНК-полімерази III E.сoli формують кільцеву структуру у вигляді фіксатора, що охоплює ДНК. Він ковзає вздовж молекули ДНК, підвищуючи продуктивність голоензиму ДНК-полімерази III у понад 500000 разів шляхом запобігання його дисоціації від ДНК. На зображенні з кінця видно дві -субодиниці у вигляді стрічкоподібних структур сірого та блакитного кольорів, що оточують просторову модель ДНК. На зображенні збоку моделі контура поверхні -субодиниць (сірого кольору) оточують подвійну спіраль ДНК (у вигляді паличок блакитного і синього кольорів) (отримано з PDB ID 2POL).

Осердя - фіксатор (-clamp) - фіксатор (відкритий) Геліказа DnaB

Вигляд з кінця Вигляд збоку

РИСУНОК 25-11. Розташування послідовностей у точці початку реплікації (ori C) в клітинах E. coil. Не дивлячись на те, що повторювані послідовності (затінено) не ідентичні, певні нуклеотиди у кожній із них однакові і формують консенсусну послідовність. У положеннях, де такий консенсус порушено, літера N означає будь-який з чотирьох нуклеотидів. Стрілками показано орієнтацію нуклеотидних послідовностей.

Три послідовності по 13 п.о. Ділянки зв”язування протеїну DnaA, чотири послідовності по 9 п.о. Консенсусна послідовність GATCTNTTNTTTT Консенсусна послідовність TTATCCACA

Таблиця 25-3

Протеїни, необхідні для ініціації реплікації у точці початку реплікації E. coli
Протеїн	Мr	Число субодиниць	Функція
Протеїн DnaA	52 000	1	Розпізнає ori-послідовність; розкриває дуплекс у точці початку реплікації
Протеїн DnaВ (геліказа)	300 000	6*	Розплітає ДНК
Протеїн DnaС	29 000	1	Необхідний для зв”язування DnaВ у точці початку реплікації
HU	19 000	2	Гістоноподібний протеїн; ДНК-зв’язувальний протеїн; стимулює ініціацію
Праймаза (протеїн DnaG)	60 000	1	Синтезує праймери РНК
Протеїн, що зв”язується з одноланцюговоюДНК (SSB)	75 600	4*	Зв'язує одноланцюгову ДНК
РНК полімераза	454 000	5	Підвищує активність DnaA
ДНК-гіраза (ДНК-топоізомераза ІІ)	400 000	4	Зменшує напруженість скручування, викликану розплітанням ДНК
Dam-метилаза	32 000	1	Метилює послідовності (5’)GATC в oriC

* У цих випадках субодиниці ідентичні

РИСУНОК 25-12 Модель ініціації реплікації у точці початку реплікації (oriC) в клітинах E.сoli.  Приблизно 20 молекул протеїну DnaA, до кожної з яких приєднана молекула АТР, зв”язуються з чотирма повторами завдовжки 9 п.о. Утворений комплекс обмотує ДНК.  Три повтори завдовжки 13 п.о., збагачені на пари А=Т, послідовно денатуруються.  Гексамери протеїну DnaB зв”язуються з кожним ланцюгом ДНК за допомогою протеїнів DnaC. DnaB-геліказа активно розплітає ДНК, готуючи її до приєднання праймера і синтезу ДНК.

Надспіралізована матриця; Три повтори по 13 п.о.; Чотири повтори по 9 п.о.; DnaB-геліказа; Приєднання праймера і реплікація.

РИСУНОК 25-13 Синтез фраґментів Оказакі. (а) Ензим праймаза через певні проміжки часу синтезує РНК-праймери для нового фраґмента Оказакі. Зауважте, що якщо дивитися на розташовані поруч два матричні ланцюги, то виглядає так, що синтез відстаючого ланцюга проходить у напрямку, протилежному до напрямку руху реплікативної вилки. (б) Кожен праймер нарощується ДНК-полімеразою ІІІ; (с) Синтез ДНК продовжується доти, доки фраґмент досягне праймера попереднього фраґмента Оказакі. Новий праймер синтезується поблизу реплікативної вилки і процес повторюється знову.

(а) ДНК-топоізомераза II (ДНК-гіраза); Синтез ведучого ланцюга (ДНК-полімераза III); Рух реплікативної вилки; Відстаючий ланцюг; DnaB-геліказа; ДНК-праймаза; РНК-праймер; Праймер РНК попереднього фраґменту Оказакі;

(б) Синтез відстаючого ланцюга (ДНК-полімераза III)

РИСУНОК 25-14 Синтез ведучого та відстаючого ланцюгів ДНК. Реакції, що відбуваються у реплікативній вилці, координує один димер ДНК-полімерази III, який функціонує у комплексі з DnaB-геліказою. На цьому рисунку наведено продовження процесу реплікації (етапи від (а) до (ґ) обговорено в тексті). Відстаючий ланцюг формує петлю, так що синтез ДНК відбувається на обох ланцюгах матриці одночасно. Червоні стрілки вказують на 3’-кінець двох нових ланцюгів і напрямок синтезу ДНК. Чорні стрілки позначають напрям руху через комплекс батьківської ДНК. Фраґмент Оказакі синтезується на відстаючому ланцюзі.

Справа: Осердя Ведучий ланцюг -Комплекс з відкритим ковзаючим β-фіксатором Відстаючий ланцюг РНК-праймер попереднього фраґмента Оказакі

(а) Безперервний синтез на ведучому ланцюзі відбувається відразу після розплітання ДНК геліказою DnaB.

Праймаза Праймер попереднього фраґменту Оказакі наближається до субодиниць осердя Праймаза Новий РНК-праймер (б) ДНК-праймаза зв’язується з DnaB, синтезує новий праймер і відділяється;

(в) Новий -фіксатор навантажується на новий матричний праймер

Синтез нового фраґменту Оказакі завершено

(г) Новий  -фіксатор Використаний  -фіксатор

(ґ) Готовий наступний β-фіксатор

Таблиця 25-4. Протеїни, які функціонують у ділянці реплікативної вилки у клітинах E. coli
Протеїн	Мr	Кількість субодиниць	Функція
SSB	75 600	4	Зв”язування з одноланцюговою ДНК
Протеїн DnaB (геліказа)	300 000	6	Розплітання ДНК; входить до складу праймосоми
Праймаза (протеїн DnaG)	60 000	1	Синтез праймера РНК; входить до складу праймосоми
ДНК-полімераза III	791 500	17	Елонгація нового ланцюга
ДНК-полімераза I	103 000	1	Заповнення розривів; вирізання праймерів
ДНК-ліґаза	74 000	1	Лігування
ДНК-гіраза (ДНК-топоізомераза II)	400 000	4	Надспіралізація

Модифіковано за Kornberg, A. (1982). Supplement to DNA replication, Table S11-2, W.H. Freeman and Company , NewYork.

РИСУНОК 25-15 Кінцеві етапи синтезу сегментів відстаючого ланцюга. Завдяки 5'→3'-ендонуклеазній активності ДНК-полімераза I видаляє РНК- праймери зі складу відстаючого ланцюга і заміщує їх на ДНК. Місце розриву зшиває ДНК-ліґаза. Роль ATP чи NAD⁺ наведено на рисунку 25-16.

Відстаючий ланцюг, Розрив ДНК-полімераза I; ДНК-ліґаза

РИСУНОК 25-16. Механізм реакції, каталізованої ДНК-ліґазою. На кожному з трьох етапів один фосфодіефірний зв”язок утворюється, а один розщеплюється. Етапи  і  ведуть до активації 5’-фосфату в місці розриву. AMP переноситься спочатку на залишок Lys у складі ензиму, а потім на 5’-фосфат у місці розриву. На етапі  3’-ОН група атакує цей фосфат і заміщає AMP, утворюючи фосфодіефірний зв”язок для зшивання розриву. У реакції, яку каталізує ДНК-ліґаза E. coli, AMP походить із NAD⁺. ДНК-ліґази, виділені з багатьох вірусних та еукаріотичних джерел, використовують ATP, а не NAD⁺, і на етапі  вивільняють пірофосфат, а не нікотинамідмононуклеотид (NMN).

Ензим- NH₃; ДНК-ліґаза; Аденилілування ДНК-ліґази; Рибоза; Аденін; AMP з ATP(R=..) чи NAD⁺ (R= NMN); PPi (з ATP); чи NMN (з NAD⁺); Ензим; Рибоза; Аденін; Ензим-AMP;;

2 Активування 5’-фосфату у місці розриву Ензим-NH₃

3 Заміщення AMP зшиває розрив Рибоза Аденін

Розрив в ДНК Рибоза Аденін ДНК-лігаза Зшита ДНК

РИСУНОК 25-17 Термінація реплікації хромосом в E. coli. (а) Ter-послідовності розташовані на хромосомі у вигляді двох угруповань (кластерів) протилежної орієнтації. (б) У процесі реплікації ДНК протилежно спрямовані реплікативні вилки роз”єднуються, а репліковані хромосоми залишаються з”єднаними у формі катенанів, тобто топологічно взаємозв’язаних кілець. Ці кільця не з”єднані ковалентно, але оскільки вони переплетені одне з одним і кожне з них ковалентно замкнене, то роз”єднання їх без участі топоізомераз неможливе. Головну роль у роз”єднанні зачеплених хромосом в E. сoli відіграє топоізомераза типу II, що називається ДНК-топоізомеразою IV; вона тимчасово розриває обидва ДНК-ланцюги однієї хромосоми, завдяки чому інша хромосома протягується через розрив.

а Точка початку реплікації вправо: Вилка, що рухається за годинниковою стрілкою; «Пастка» вилки, що рухається проти годинникової стрілки «Пастка» вилки, що рухається за годинниковою стрілкою Вилка, що рухається проти годинникової стрілки

б Вилка, що рухається проти годинникової стрілки; Вилка, що рухається за годинниковою стрілкою завершення реплікації Катеновані хромосоми; ДНК-топоізомераза IV; Роз”єднані хромосоми

РИСУНОК 25-18. Процесс розходження хромосом у бактерій. (а) Увесь процес реплікації відбувається у головній «реплікаційній фабриці», до складу якої входить дві реплікативні вилки. (б) Дві репліковані копії бактеріальної хромосоми витісняються з «реплікаційної фабрики» у різні половинки клітини; ймовірно, що кожна з них має новосинтезовану точку початку реплікації, які зв’язані з різними ділянками плазматичної мембрани. Ізолювання двох копій хромосоми у різних половинках клітини полегшує їх правильне розходження до дочірніх клітин під час поділу материнської клітини.

б –origin Точка початку реплікації вправо: Бактерія початок реплікації Реплісома розділення точок початку реплікації розтягнення клітини у ході реплікації розходження хромосом поділ клітини Хромосома Термінатор

РИСУНОК 25-19 Тест Еймса на канцероґени, який грунтується на їхній мутагенності. Штам Salmonella typhimurium, який містить мутацію, що інактивує ензим шляху біосинтезу гістидину, висівають на середовище без гістидину. Виростає лише декілька клітин. (а) Декілька малих колоній S. typhimurium, що виросли на середовищі без гістидину, несуть спонтанні зворотні мутації, внаслідок чого функціонування шляху біосинтезу гістидину відновлюється. У три чашки з ідентичним середовищем (б), (в) і (г) висіяли однакову кількість клітин. У кожну з них помістили диск з фільтрувального паперу, що містив все нижчі концентрації мутаґену. Мутаґен значно збільшував частоту зворотних мутації, а, отже, і кількість колоній. Чиста поверхня навколо фільтра вказує, яка концентрація мутаґену була летальною для клітин. Оскільки дифузія мутаґену відбувається у напрямку від фільтра, то його концентрація зменшується до сублетальної, яка прискорює зворотну мутацію. Мутаґени можна порівняти на підставі їхнього впливу на частоту мутацій. Оскільки багато речовин після проникнення у клітину зазнають різноманітних хімічних перетворень, то деколи тест на їхню мутаґенність провадять після інкубації з екстрактом печінки. Мутаґенність деяких речовин було виявлено лише після такої обробки.

РИСУНОК 25-20 Метилювання і репарація помилок спаровування. У ДНК E. сoli метилювання ланцюгів служить для розрізнення батьківських (матричних) ланцюгів від новосинтезованих, що відіграє визначальну роль у репарації помилкового спаровування (див. Рис. 25-21). Метилювання відбувається в N⁶-положенні молекул аденінів, розташованих у послідовності (5’)GATC. Ця послідовність є паліндромом (див. Рис. 8-20) і наявна в обох ланцюгах ДНК у протилежній орієнтації.

реплікація Зразу ж після реплікації метилюється матричний, але не новосинтезований ланцюг Напівметильована ДНК; Dam-метилаза На декілька хвилин пізніше метилюється і новосинтезований ланцюг, тепер два ланцюги розрізнити неможливо.

РИСУНОК 25-21 Модель ранніх етапів метил-спрямованої репарації помилок спаровування. Протеїни, що беруть участь у цьому процесі в клітинах E. сoli, виділено у чистому вигляді (див. Табл. 25-5). Розпізнавання послідовності (5’)GATC та некомплементарно спарованих основ здійснюють, відповідно, протеїни MutH та MutS. Протеїн MutL формує комплекс з протеїном MutS у місці помилкового спаровування. ДНК протягується через цей комплекс таким чином, що комплекс одночасно рухається в обох напрямках вздовж ДНК, аж доки не зустрінеться з протеїном MutH, зв’язаним у ділянці напівметильованої послідовності GATC. MutH рощеплює неметильований ланцюг на 5’-стороні основи G у цій послідовності. Далі комплекс, що складаєтсья з ДНК-гелікази II і однієї чи кількох екзонуклеаз, деградує неметильований ланцюгДНК з цієї точки до місця помилки. (Рис. 25-22).

Комплекс MutL-MutS;

MutH розщеплює немодифікований ланцюг

РИСУНОК 25-22 Завершення метил-спрямованої репарації помилки спаровування. Завдяки спільній дії ДНК-гелікази II, SSB і однієї з чотирьох екзонуклеаз видаляється сеґмент новосинтезованого ланцюга ДНК між місцем розщеплення, здійсненим протеїном MutH, і точкою, що знаходиться зразу за помилкою. Використання певної екзонуклеази залежить від розташування місця розщеплення по відношенню до місця помилкового спаровування. Утворений проміжок заповнює ДНК-полімераза III, а розрив ланцюга зшиває ДНК-ліґаза (не наведено) .

ДНК-геліказа ІІ екзонуклеаза VII або RecJ-нуклеаза

ДНК-полімераза III

ДНК-геліказа II; екзонуклеаза I або екзонуклеаза X; ДНК-полімераза III

РИСУНОК 25-23. Репарація ДНК шляхом вирізання основ.  ДНК-ґлікозилаза розпізнає пошкоджену основу і розщеплює ланцюг між нею і дезоксирибозою.  АП-ендонуклеаза розщеплює фосфодіефірний зв”язок ланцюга поблизу АП-сайту.  ДНК-полімераза I ініціює репаративний синтез, починаючи від вільного 3’-гідроксилу у місці розриву; завдяки наявності 5’3’-ендонуклеазної активності цей ензим видаляє сеґмент ушкодженого ланцюга і заміщує його непошкодженою ДНК.  Після від'єднання ДНК-полімерази I місце розриву зашиває ДНК-ліґаза.

ДНК-ґлікозилаза; Ушкоджена основа; АП-ендонуклеаза; ДНК-полімераза I; Дезоксирибозофосфат Нова ДНК Розрив; ДНК-ліґаза

РИСУНОК 25-24. Репарація шляхом вирізанням нуклеотидів в E. сoli та людини. Загалом цей шлях репарації подібний в усіх організмів.  Ензим ексцинуклеаза зв”язується з ДНК у місці великого ушкодження і розщеплює ланцюг з обох сторін цього ушкодження.  ДНК-геліказа видаляє сеґмент ДНК, що складається із 13 (13 мер) чи 29 нуклеотидів (29 мер).  Проміжок заповнює ДНК-полімераза, а  розрив зшиває ДНК-ліґаза.

Ушкодження ДНК; ексцинуклеаза Е.coli; ексцинуклеаза людини; ДНК-геліказа -2 рази; 13 мер 29 мер ДНК-полімераза I; ДНК-полімераза ; ДНК-ліґаза; ДНК-ліґаза;

РИСУНОК 25-25. Репарація піримідинових димерів фотоліазою. Для виправлення ушкоджень, спричинених фотореакціями, використовується енерґія поглиненого світла. У складі фотоліази E. сoli (М_r 54 000) містяться два хромофори - N⁵,N¹⁰ –метенілтетрагідрофолілполіґлутамат (MTHFpolyGlu) і FADH^-, які виконують взаємодоповнювальні функції. У випадку зв”язування фотоліази з піримідиновим димером процес репарації відбувається наступним чином.  Фотон синього світла (довжина хвилі 300-500 нм) поглинається MTHFpolyGlu, який функціонує у ролі фотоантени.  Енерґія збудження передається на FADH ^-, розташований в активному центрі ензиму.  Збуджений флавін (*FADH ^-) віддає електрон піримідиновому димеру (наведено у спрощеному вигляді), що веде до утворення нестабільного димерного радикалу.  Унаслідок перегрупування електронів знову відновлюються мономерні піримідини, а  електрон переноситься назад до флавінового радикалу, що веде до реґенерації FADH ^-.

Циклобутановий піримідиновий димер Флавіновий радикал Мономерні піримідини у репарованій ДНК

Правка з Америки – кружечки з цифрами зробити так, як на інших малюнках

РИСУНОК 25-26 Приклад того, як ушкодження ДНК призводить до мутацій. (а) Продукт метилювання О⁶–метилґуанін легше утворює пару з тиміном, ніж з цитозином. (б) Якщо не відбудеться репарації, то після реплікації це призведе до мутації G≡C на А=Т.

Ґуанін; Цитозин; метилювання і реплікація; О⁶-Метилґуанін; Тимін; метилювання реплікація; Правильно спарована ДНК (мутацій немає);

Формула:

активний О⁶–Метилґуаніновий нуклеотид; метилтрансфераза; неактивний Ґуаніновий нуклеотид

РИСУНОК 25-27. Пряма репарація алкільованих основ за участю AlkB. Протеїн AlkB – це α-кетоґлютарат-Fe²⁺-залежна оксидаза. Він каталізує окисне деметилювання залишків 1-метиладеніну і 3-метилцитозину.

1-Метиладенін α-Кетоґлютарат Сукцинат Формальдегід Аденін

3-Метилцитозин α-Кетоґлютарат Сукцинат Формальдегід Цитозин

РИСУНОК 25-28. Ушкодження молекули ДНК та їх вплив на процес реплікації. Якщо реплікативна вилка зустрічає на своєму шляху невиправлене ушкодження чи розрив ланцюга, то процес реплікації зупиняється, а сама вилка може зруйнуватися. Унаслідок цього ушкоджена ділянка залишається у вигляді нереплікованого одноланцюгового сеґмента ДНК; розрив в одному ланцюзі перетворюється на розрив подвійного ланцюга. У кожному із цих випадків пошкодження одного ланцюга не може бути виправлене за допомогою описаних вище механізмів, оскільки комплементарний ланцюг, необхідний для прямої точної репарації, також пошкоджений, або його взагалі немає. Існує два можливі шляхи виправлення таких ушкоджень: рекомбінативна репарація ДНК (див. Рис. 25-37), чи, у разі численних ушкоджень, - репарація з пропуском помилок. (error-prone repair)/ В останньому механізмі задіяна нововідкрита ДНК-полімераза (ДНК-полімераза V, що кодується ґенами umuC та umu D), яка здатна реплікувати, хоча і неточно, різноманітні типи ушкоджень. Такий механізм називають репарацією з пропуском помилок через те, що наслідком її часто є виникнення мутацій.

Нерепароване ушкодження Нерепарований розрив Одноланцюгова ДНК Подвійноланцюговий розрив Рекомбінативна репарація ДНК або репарація з пропуском помилок; Рекомбінативна репарація ДНК

Таблиця 25-5. Типи систем репарації ДНК в E.coli

Ензими/протеїни Тип ушкодженя

Репарація помилок спаровування Dam-метилаза Помилкові спаровування Протеїни MutH, MutL, MutS ДНК-геліказа ІІ SSB ДНК-полімераза III Екзонуклеаза I Екзонуклеаза VII Нуклеаза RecJ Екзонуклеаза X ДНК-ліґаза

Репарація шляхом вирізання основ ДНК-ґлікозилази Аномальні основи (урацил, гіпоксантин, ксантин); алкільовані основи; в деяких інших організмах - піримідинові димери АП-ендонуклеази ДНК-полімераза І ДНК-ліґаза Репарація шляхом вирізання нуклеотидів ABC-ексцинуклеази ДНК-полімераза I ДНК-лігаза Ушкодження ДНК, що спричиняють великі структурні зміни (напр., піримідинові димери)

Пряма репарація ДНК-фотоліази Піримідинові димери O6-Метилґуанін- ДНК-метилтрансфераза O6-Метилґуанін Протеїн AlkB 1-Метилґуанін, 3-метилцитозин

Таблиця 25-6 Ґени, індукція яких є частиною SOS-відповіді у E.coli

Назва ґену Кодований протеїн і/чи його роль у репарації ДНК

Ґени з відомими функціями polB (dinA) Кодує полімеризуючу субодиницю ДНК-полімерази II, яка необхідна для відновлення реплікації у процесі рекомбінативної репарації ДНК

uvrA uvrB Кодують субодиниці ABC-ексцинуклеаз UvrA і UvrB

umuC umuD Кодують ДНК-полімеразу V

sulA Кодує протеїн, який інгібує поділ клітини, можливо для того, щоб надати час для репарації ДНК

recA Кодує протеїн RecA, необхідний для схильної до помилок репарації і рекомбінативної репарації

dinB Кодує ДНК-полімеразу IV

Ґени, що беруть участь у метаболізмі ДНК, але їхня роль у репарації ДНК не встановлена ssb Кодує протеїн, здатний зв”язуватися з одноланцюговою ДНК (SSB)

uvrD Кодує ДНК-геліказу II (протеїн, який розплітає ДНК)

himA Кодує субодиницю інтегративного фактора хазяїна (IHF, від англ. integration host factor), що бере участь у сайт-специфічній рекомбінації, реплікації, транспозиції і реґуляції експресії ґенів

recN Необхідний для рекомбінативної репарації

Ґени, функції яких невідомі dinD dinF

РИСУНОК 25-29. Мейоз в еукаріотичних клітинах зародкової лінії. Хромосоми гіпотетичної диплоїдної клітини зародкової лінії (шість хромосом, три гомологічні пари) реплікуються і утримуються разом своїми центромерами. Кожну репліковану подвійноланцюгову молекулу ДНК називають хроматидою (сестринською хроматидою). У профазі I, перед першим мейотичним поділом, три гомологічні набори хроматид розташовуються паралельно, формуючи тетради, які утримуються разом за допомогою ковалентних зв”язків у місцях гомологічних з’єднань (хіазм). Кросинговер відбувається саме у ділянці хіазм (див. Рис. 25-30). Такі тимчасові з'єднання гомологів забезпечують точне розділення зв”язаних хромосом на наступному етапі, коли вони міґрують до протилежних полюсів клітини під час першого мейотичного поділу. Внаслідок цього поділу утворюються дві дочірні клітини , кожна з яких має три пари хроматид. Ці пари тепер розташовуються в екваторіальній площині клітини, після чого відбувається розходження хроматид (які тепер називаються хромосомами). Внаслідок другого мейотичного поділу утворюється чотири дочірні клітини з гаплоїдним набором хромосом, що функціонують як ґамети. Кожна з них має три хромосоми, тобто половину від їхньої кількості у диплоїдній клітині зародкової лінії. Таким способом відбувається перерозподіл і рекомбінація хромосом.

Диплоїдна клітина зародкової лінії реплікація Профаза І розділення гомологічних пар перший мейотичний поділ другий мейотичний поділ Гаплоїдні ґамети

РИСУНОК 25-33. Геліказна і нуклеазна активності ензиму RecBCD. Зв’язуючись з кінцем подвійного ланцюга ДНК, RecBCD розкручує і розщеплює її доти, доки не зустрінеться з послідовністю chi. Взаємодія з цією послідовністю змінює активність RecBCD таким чином, що ензим утворює одноланцюгову ДНК з 3’-кінцем, яка використовується на наступних етапах рекомбінації. Переміщення ензиму відбувається за рахунок гідролізу ATP. Вважають, що цей ензим допомагає ініціювати гомологічну ґенетичну рекомбінацію у клітинах E. сoli, а також бере участь у репарації подвійноланцюгових розривів у зруйнованих реплікативних вилках.

Ензим RecBCD; RecBCD розщеплює ДНК завдяки наявності геліказної і нуклеазної активностей

Взаємодія з chi-послідовністю пригнічує нуклеазну активність на 3’-кінці ланцюга. Розщеплення іншого ланцюга продовжується, внаслідок чого утворюється 3’-одноланцюговий кінець

РИСУНОК 25-30. Кросинговер. (а) Унаслідок кросинговеру часто відбувається обмін генетичним матеріалом між гомологічними хромосомами. (б) Зображено гомологічні хромосоми коника-стрибунця у профазі І мейозу. Між двома гомологічними парами хроматид видно численні точки з”єднання (хіазми). Їх наявність слугує фізичним підтвердженням того, що тут відбулися гомологічні рекомбінації (кросинговери).

Гомологічна пара; Центромера; Гомолог; Сестринські хроматиди; Тетрада; Точка кросинговеру (хіазма)

2 мкм Центромери Хроматиди

РИСУНОК 25-31. Рекомбінація під час мейозу. (а) Модель репарації розриву подвійного ланцюга ДНК для гомологічної ґенетичної рекомбінації. Дві гомологічні хромосоми, задіяні у цій рекомбінації, мають подібні послідовності нуклеотидів. Кожен з двох наведених ґенів має різні алелі у складі хромосом. Щоб простежити хід процесу рекомбінації, ланцюги ДНК та алелі помічено різними кольорами, а сам процес поетапно описано в тексті. (б) Електронна мікрофотографія проміжної структури Голлідея, що утворюється між двома бактеріальними плазмідами in vivo. Проміжна структура названа на честь Робіна Голлідея, який вперше 1964 р. передбачив її існування.

Ґен А; Ґен В  Розрив подвійного ланцюга в одному з двох гомологів розширюється завдяки дії екзонуклеаз. 3’-кінці ланцюгів ДНК розщеплюються меншою мірою порівняно з 5’-кінцями, внаслідок чого утворюються 3’-виступи одноланцюгової ДНК.

 3’-кінець спаровується із своїм комплементом у складі інтактного гомолога. Інший ланцюг дуплекса заміщується.

 Подовження 3’-кінця відбувається за участю ДНК-полімерази, а також завдяки міґрації гілки, внаслідок чого утворюється молекула ДНК з двома схрещеними ділянками (кросоверами), що носить назву проміжної структури Голлідея;

 У ході подальшої реплікації ДНК відбувається добудова ділянки ДНК на місці первиннного розриву подвійного ланцюга.

 Унаслідок розщеплення проміжної структури Голлідея спеціалізованими нуклеазами може утворитися будь-який із двох рекомбінантних продуктів. У продукті 2 ДНК на обох сторонах ділянки, що зазнала репарації, рекомбінована.

Продукт 1 Продукт 2

РИСУНОК 25-32 Міґрація гілки ДНК. Якщо матричний ланцюг спаровується з двома різними комплементарними ланцюгами, то у точці, де зустрічаються всі три комплементарні ланцюги, формується гілка. Така гілка «мігрує» внаслідок розщеплення зв’язку основи з одним із двох комплементарних ланцюгів і спаровуванням з іншим комплементраним ланцюгом. За відсутності ензиму, що регулює цей процес, гілка може рухатися спонтанно у будь-якому напрямку. Спонтанна міґрація гілки блокується у випадку появи у будь-якому із протилежно розташованих комплементарних ланцюгів послідовності, неідентичної до послідовності в іншому ланцюзі.

РИСУНОК 25-34. Протеїн RecА. (а) Вигляд під електронним мікроскопом нуклеопротеїнового філамента протеїну RecА, розташованого на одноланцюговій ДНК. Смугастість відображає правозакручену спіральну структуру філамента. (б) Модель контура поверхні філамента RecA, що складається з 24-х субодиниць; на один виток припадає 6 субодиниць. Одна із субодиниць затінена червоним кольором для чіткішого зображення її розташування (отримано з PDB ID 2REB).

РИСУНОК 25-35. Прискорення протеїном RecA реакцій обміну ланцюгів ДНК в умовах in vitro. Реакція обміну ланцюгами полягає у від”єднанні одного ланцюга зі складу дуплекса ДНК, перенесення його до альтернативного комплементарного ланцюга і формування нового дуплекса (гетеродуплекса) ДНК. У процесі перенесення утворюється розгалужена проміжна структура. Формування кінцевого продукту залежить від міґрації гілки ДНК, що прискорюється протеїном RecA. Реакція може включати три ланцюги (зліва) або взаємний (реципрокний) обмін між двома гомологічними дуплексами, тобто загалом чотири ланцюги (справа). У тому випадку, коли в процесі задіяно чотири ланцюги, розгалужена проміжна структура утворює проміжну структуру Голлідея. Протеїн RecA прискорює процеси міграції гілок ДНК у цих реакціях, використовуючи енергію гідролізу ATP.

Кільцева одноланцюгова ДНК; Кільцевий дуплекс ДНК з прогалиною в одному із ланцюгів; Гомологічний лінійний дуплекс ДНК; Протеїн RecA Протеїн RecA Розгалужені проміжні структури

Протеїн RecA зв’язується з одноланцюговою ДНК, чи ДНК, що містить розрив. Комплементарний ланцюг лінійної ДНК з’єднується з кільцевим одинарним ланцюгом. Інший лінійний ланцюг ДНК витісняється (зліва) чи з’єднується з комплементарним ланцюгом кільцевого дуплекса з утворенням структури Голлідея (справа).

Протеїн RecA Протеїн RecA

У разі безперервної міграції гілки ДНК утворюється кільцевий дуплекс з розривом і витіснений лінійний ланцюг (зліва) або частково одноланцюговий лінійний дуплекс (справа).

РИСУНОК 25-36. Модель обміну ланцюгів ДНК, опосередкованого протеїном RecA. Навідено хід реакції, в якій беруть участь три ланцюги ДНК. Протеїн RecA позначено кульками, розмір яких зменшений відносно товщини молекули ДНК для того, щоб було зручно простежити за змінами, які відбуваються з ланцюгами ДНК.  Протеїн RecA формує філамент на одноланцюговій ДНК.  В утворений комплекс включається гомологічний дуплекс.  Перемотування зміщує триланцюгову ділянку у напрямку зліва направо. Один з ланцюгів дуплексу переноситься на одинарний ланцюг ДНК, що входив до складу філамента, а інший витісняється і всередині філаменту формується новий дуплекс. По мірі подальшого обертання ( і ) витіснений ланцюг повністю відділяється. Згідно цієї моделі, за рахунок гідролізу молекул ATP протеїном RecA відбувається обертання двох молекул ДНК по відношенню одна до одної, а, отже, і спрямування процесу обміну ланцюгами зліва направо, як показано на схемі.

Протеїн RecA; Гомологічний дуплекс ДНК; Проміжна структура з трьох спарованих ланцюгів Гомологічний дуплекс ДНК; Точка розгалуження; Обертання перемотує ДНК Міґрація гілки ДНК;

РИСУНОК 25-37 Моделі рекомбінативної ДНК-репарації зупинених реплікативних вилок. У разі натрапляння на ушкоджену ділянку ДНК (зліва) чи розрив ланцюга (справа) реплікативна вилка руйнується. Рекомбінативні ензими прискорюють перенесення ланцюга ДНК, необхідногo для репарації розгалуженої структури ДНК у реплікативній вилці. Пошкодження у вигляді прогалини в одному ланцюзі репарується за допомогою реакції, в якій беруть участь протеїни RecF, RecO та RecR. Подвійноланцюгові розриви репаруються шляхом, в якому бере участь ензим RecBCD. В обох шляхах задіяний також протеїн RecA. Рекомбінаційні проміжні структури зазнають дії додаткових ензимів (наприклад RuvA, RuvB, а також RuvC, який діє на проміжні структури Голлідея). Ушкодження в подвійноланцюговій ДНК виправляються або шляхом вирізання нуклеотидів, або іншими шляхами. Реплікативна вилка відновлюється за допомогою ензимів, які каталізують поновлення реплікації незалежно від точки її початку, внаслідок чого завершується реплікація всієї хромосоми. Загалом здійснення цього процесу потребує точної координації всіх аспектів метаболізму бактеріальної ДНК.

Пошкодження ДНК зліва: повернення вилки реплікація зворотна міґрація гілки

Справа: Розрив ДНК проникнення ланцюга міграція гілки розділення з'єднання Голлідея

Відновлення реплікації, незалежно від точки її початку

РИСУНОК 25-38. Реакція сайт-специфічної рекомбінації (а) Зображена реакція належить до загального класу реакцій, каталізованих сайт-специфічними рекомбіназами, які називають рекомбіназами класу інтеґраз (названі так після того, як було охарактеризовано першу рекомбіназу - інтеґразу бактеріофаґу ). Реакція протікає всередині тетрамеру ідентичних субодиниць. Субодиниці рекомбінази зв”язуються зі специфічною послідовністю, яку часто називають просто сайтом рекомбінації.  Один з ланцюгів у кожній молекулі ДНК розщеплюється у певних точках всередині послідовності. Нуклеофілом слугує ОН-група залишку Tyr у складі активного центру, а продуктом - ковалентний фосфотирозиновий зв”язок між протеїном і ДНК.  Розщеплені ланцюги з’єднуються з новими партнерами, утворюючи проміжну структуру Голлідея. Етапи  і  завершують реакцію, відбуваються вони аналогічно першим двом етапам. Після рекомбінації ділянок ДНК, що фланкують сайт рекомбінації, відновлюється його вихідна послідовність. Описані етапи проходять всередині комплексу, що складається із численних субодиниць рекомбінази, іноді він включає і інші, не вказані тут протеїни. (б) Модель контура поверхні чотирьохсубодничної рекомбінази класу інтеґраз, яка має назву рекомбіназа Cre і зв”язана з проміжною структурою Голлідея (зображено у вигляді спіральних ланцюгів блакитного та синього кольору). Протеїн зображено прозорим для того, щоб було видно зв”язану ДНК (отримано з PDB ID 3CRX).

Рекомбіназа

РИСУНОК 25-39 Результати сайт-специфічної рекомбінації. Результат сайт-специфічної рекомбінації залежить від розташування і орієнтації ділянок (сайтів) рекомбінації (позначені червоним та зеленим кольорами) у подвійноланцюговій молекулі ДНК. У наведеному випадку орієнтація (вказана стрілками) стосується порядку нуклеотидів у сайті рекомбінації, а не у напрямку 5’→3’. (а) Сайти рекомбінації мають протилежну орієнтацію в одній і тій же молекулі ДНК, результатом процесу рекомбінації у цьому випадку буде інверсія. (б) Якщо сайти рекомбінації мають однакову орієнтацію і локалізовані в одній і тій же молекулі ДНК, то рекомбінація призводить до делеції, а якщо локалізовані у двох молекулах ДНК – до інсерції.

Інверсія ; Сайти обміну;

Делеція та інсерція інсерція делеція

Рисунок 25-40. Інтеграція і вирізання ДНК бактеріофага  у хромосомному сайті - мішені. У ділянці кросинговеру сайти приєднання у складі ДНК фага  (attP) і ДНК бактерії (attB) мають повністю гомологічних лише 15 п.о. Під час реакції утворюються два нових сайти приєднання (attR і attL), які фланкують інтеґровану ДНК фаґа. У якості рекомбінази функціонує -інтеґраза (іноді позначають як INT-протеїн). У процесах інтеграції та вирізання використовуються різні сайти приєднання і різні додаткові протеїни. Для вирізання використовуються протеїн XIS, який кодується бактеріофаґом, і протеїн FIS, який кодується бактерією. Для обох реакцій необхідний протеїн IHF (від англ. integration host factor - інтеґраційний фактор хазяїна), що кодується бактерією.

Бактеріальний сайт приєднання (attB) Фаговий сайт приєднання (attP) Точка кросинговеру ДНК фага  Інтеграція: -інтеґраза Вирізання: -інтеґраза І нтегрована ДНК фага  (профаг)

Хромосома E coli

Рисунок 25-41 Делеція ДНК для усунення шкідливого впливу рекомбінативної репарації ДНК. Унаслідок розщеплення проміжної структури Голлідея під час рекомбінативної репарації ДНК (у разі розрізання в точках, позначених червоними стрілками) може утворитися з’єднана димерна хромомсома. Спеціалізована сайт-специфічна рекомбіназа E. сoli, а саме XerCD, перетворює димер у мономери, уможливлюючи таким чином розходження хромосом і подальший хід процесу поділу клітин.

Реплікативна вилка, де відбувається рекомбінативна репарація ДНК завершення реплікації Димерний ґеном розщеплення до мономерів, здійснюване системою XerCD.

РИСУНОК 25-42 Дуплікація послідовності ДНК у сайті-мішені під час інсерції транспозону. Дупліковані послідовності зображено червоним кольором. На рисунку розмір їх значно збільшено (порівняно з розміром типового транспозону), зазвичай довжина його складає декілька пар основ.

Кінцеві повтори Транспозон; Транспозаза робить зміщені розрізи в сайті-мішені ДНК-мішень

Інсерція транспозона у ділянці розрізів;

Проміжки заповнюються завдяки реплікації, водночас дуплікуються послідовності, які фланкують транспозон

РИСУНОК 25-43 Два основні шляхи транспозиції: прямий (простий) і реплікативний.  На першому етапі відбувається розщеплення ДНК з обох сторін транспозону у місцях, позначених стрілками.  Вивільнені 3’-гідроксильні групи на кінцях транспозону діють як нуклеофіли, прямо атакуючи фосфодіефірні зв’язки в обох ланцюгах ДНК-мішені, які внаслідок цього зміщуються (тобто розташовуються не прямо один навпроти іншого).  Тепер транспозон зв’язується з ДНК-мішенню. У разі прямої транспозиції утворені на обох кінцях проміжки заповнюються внаслідок реплікації, а у разі реплікативної транспозиції транспозон реплікується повністю і утворюється коінтеґративна проміжна структура.  Часто коінтеґрат згодом розкладається за допомогою окремої сайт-специфічної рекомбінативної системи. Розщеплена ДНК хазяїна, яка залишається після прямої транспозиції, або репарується шляхом з’єднання кінців ДНК, або ж деґрадує (не показано). В останньому випадку організм може загинути.

Пряма транспозиція Реплікативна транспозиція; Розщеплення ДНК-мішень; Вільні кінці транспозонів атакують ДНК-мішень; Заповнення проміжків (зліва) або повна реплікація транспозона (справа) ДНК-полімераза ДНК-ліґаза; реплікація; Коінтеґрат; Сайт-специфічна рекомбінація (всередині транспозону).

РИСУНОК 25-44 Рекомбінація V- і J-сеґментів ґена легкого ланцюга родини каппа IgG людини. Унаслідок цього процесу утворюються різноманітні антитіла. Зверху наведено розташування послідовностей, що кодують IgG, у стовбурових клітинах кісткового мозку. Під час рекомбінації видаляється ділянка ДНК між специфічними сеґментами V і J. Після транскрипції отриманий транскрипт піддається РНК-сплайсингу, як описано у розділі 26; внаслідок трансляції утворюється поліпептид легкого ланцюга. Легкий ланцюг може поєднуватися з будь-яким із 5 000 наявних важких ланцюгів з утворенням молекул антитіл.

V-сеґмент (від 1 до ~300); J-сеґмент; С-сеґмент; ДНК клітини зародкової лінії рекомбінація веде до делеції ДНК між сеґментами V і J; Завершений ґен легкого ланцюга ДНК B-лімфоцита; транскрипція; Первинний транскрипт; видалення послідовностей між J₄ і С шляхом сплайсингу мРНК; Зріла мРНК трансляція Поліпептид легкого ланцюга Варіабельна ділянка; Стабільна ділянка; згортання і збирання протеїну; Легкий ланцюг; Важкий ланцюг; Молекула антитіла.

РИСУНОК 25-45 Механізм перебудови гена іміноглобуліну. Протеїни RAG1 і RAG2 зв’язуються з рекомбінативними сигнальними послідовностями (RSS) і розрізають один ланцюг ДНК між RSS і сеґментами V ( чи J), які підлягають з’єднанню. Вивільнений 3’-гідроксил діє як нуклеофіл, атакуючи фосфодіефірний зв’язок у складі другого ланцюга ДНК, внаслідок чого виникає подвійноланцюговий розрив. Утворені на кінцях розрізаних сеґментів V і J шпильки розщеплюються, після чого їх кінці ковалентно з’єднуються за допомогою комплексу специфічних протеїнів, які репарують подвійноланцюгові розриви. Хімічний механізм етапів утворення розриву подвійного ланцюга, каталізованих протеїнами RAG1 і RAG2, подібний до етапів реакцій транспозиції ДНК.

V-сеґмент; Вставка ДНК; J-сеґмент; розщеплення; внутрішньомолекулярна трансетерифікація; репарація розриву подвійного ланцюга шляхом з’єднання кінців.