25.1 Реплікація днк

Ще задовго до з’ясування структури ДНК науковців цікавила здатність організмів відтворювати точні копії самих себе, а пізніше і здатність клітин утворювати велику кількість ідентичних копій великих і складних макромолекул. Дослідження цих проблем привело до створення концепції матриці, тобто структури, яка забезпечує специфічне лінійне упорядкування молекул та їх з'єднань, внаслідок чого формується макромолекула з унікальною послідовністю і функцією. У 1940х рр. стало зрозуміло, що генетична інформація міститься в ДНК, але тільки після відкриття її структури Джеймсом Вотсоном і Френсісом Кріком було визначено принцип використання ДНК у якості матриці для реплікації та передачі ґенетичної інформації, який описується так: один ланцюг є комплементарним до іншого (з англ. complement - доповнення). Строгі правила спаровування основ означають, що кожен ланцюг служить матрицею для іншого ланцюга з передбачуваною і комплементарною послідовністю (Рис. 8-16, 8-17).  Нуклеотиди: будівельні блоки нуклеїнових кислот.

Головні особливості процесу реплікації ДНК і механізми, за допомогою яких ензими каталізують його проходження, практично ідентичні у всіх організмів. Тому цьому питанню ми приділятимемо основну увагу впродовж розгляду загальних особливостей процесу реплікації, властивостей реплікативних ензимів клітин E.сoli та специфіки реплікації ДНК у клітинах еукаріотів.

Процес реплікації ДНК підпорядковується низці фундаментальних правил

Першими дослідженнями процесу реплікації бактеріальної ДНК і задіяних у ньому ензимів було встановлено декілька базових характеристик, які виявилися спільними для синтезу ДНК в усіх орґанізмах.

Реплікація ДНК відбувається напівконсервативним способом. Кожний ланцюг ДНК слугує матрицею для синтезу нового ланцюга, внаслідок чого утворюється дві нові молекули ДНК, кожна з яких має один новий і один старий ланцюг. Цей процес називається напівконсервативною реплікацією.

Гіпотезу напівконсервативної реплікації запропонували Д. Вотсон і Ф. Крік незабаром після публікації 1953 р. своєї статті про структуру ДНК, а підтвердили її майстерно виконаними експериментами Метью Мезельсон і Франклін Сталь 1957 р. Вчені вирощували клітини E. сoli впродовж багатьох поколінь на середовищі, до складу якого як єдине джерело азоту входив NH₄Cl; ця сполука замість звичайного, більш розповсюдженого “легкого” ізотопу азоту - ¹⁴N, містила “важкий” ізотоп - ¹⁵N. Густина препарату ДНК, виділеної з таких клітин, була приблизно на 1% більша, ніж звичайної [¹⁴N]ДНК (Рис. 25-2а). Хоча ця різниця і невелика, проте суміш важкої [¹⁵N]ДНК і легкої [¹⁴N]ДНК можна розділити методом центрифуґування у ґрадієнті густини хлористого цезію.

Клітини E. сoli, що росли на середовищі з [¹⁵N], переносили на нове середовище, яке містило лише ізотоп [¹⁴N]; на цьому середовищі клітини росли впродовж часу, необхідного для подвоєння їхньої популяції. ДНК, виділена з клітин цієї першої ґенерації, формувала одну смугу в ґрадієнті CsCl у положенні, яке вказувало на те, що подвійноспіральні молекули ДНК дочірніх клітин були гібридами і містили один новий [¹⁴N]-ланцюг та один батьківський [¹⁵N]-ланцюг (Рис. 25-2б).

Ці результати свідчили проти альтернативної гіпотези консервативної реплікації, згідно якої дочірня молекула ДНК повинна складатися з двох новосинтезованих ланцюгів, а вихідна - мати два батьківські ланцюги; у такому разі в експерименті Мезельсона–Сталя не утворилися б гібридні молекули. Гіпотеза напівконсервативної реплікації була також підтверджена у подальших експериментах (Рис. 25-2в). Клітини продовжували культивувати на середовищі з [¹⁴N] до другого подвоєння їхньої популяції. Препарат ДНК, ізольованої після другого циклу реплікації, у ґрадієнті щільності розділився на дві смуги. Одна смуга відповідала “легкій” ДНК, а друга - гібридній ДНК, як і у випадку після першого подвоєння клітин.

Реплікація починається з певної точки і відбувається в обох напрямках. Після підтвердження напівконсервативного механізму реплікації виникла низка інших запитань. Чи повністю розплітаються ланцюги батьківської ДНК перед реплікацією? Починається реплікація з випадкової, чи з певно визначеної точки? Після ініціації процес реплікації ДНК відбувається в одному чи в обох напрямках?

Перші докази того, що процес реплікації є чітко скоординованим процесом, під час якого ланцюги батьківської ДНК розплітаються і реплікуються одночасно, були отримані Джоном Кернсом за допомогою методу авторадіографії. ДНК E. сoli радіоактивно мітили шляхом вирощування клітин на середовищі, що містило мічений тритієм (³Н) тимідин. Після обережного виділення ДНК наносили на підложку, покривали фотографічною емульсією і витримували впродовж декількох тижнів. За цей час радіоактивні залишки тимідину формували в емульсії “сліди” (або треки) із зерен срібла, внаслідок чого отримували зображення молекули ДНК. На підставі аналізу зображень було встановлено, що хромосома E .сoli – це одна велика кільцева структура завдовжки 1.7 мм. Радіоактивна ДНК, виділена з клітин під час реплікації, мала додаткову петлю (Рис. 25-3а). Кернс зробив висновок, що ця петля утворилася внаслідок формування двох радіоактивних дочірніх ланцюгів, кожний з яких комплементарний до батьківського. Один або обидва кінці петлі є динамічними точками, їх називають реплікативними вилками, в яких батьківська ДНК розплітається, а роз”єднані ланцюги швидко реплікуються. Результати дослідів Кернса продемонстрували, що обидва ланцюги ДНК реплікуються одночасно, а варіації в його експерименті (Рис. 25-3б) вказують на те, що реплікація бактеріальних хромосом відбувається в обох напрямках, оскільки обидва кінці петлі містили активні реплікативні вилки.

Для визначення того, чи реплікаційні петлі виникають в єдиній точці молекули ДНК, її потрібно було помітити по всій довжині певними орієнтирами. Цього було досягнуто за допомогою методики денатураційного картування, розробленої Россом Інманом зі співробітниками. У дослідах з хромосомою бактеріофаґу  завдовжки 48502 п.о. вчений виявив, що ДНК можна вибірково денатурувати у ділянках з високим вмістом пар А=Т, внаслідок чого отримують відтворюване зображення одноланцюгових «бульбашок» (інша назва – вічок, див. рис. 8-31). Таким же способом можна частково денатурувати ізольовану ДНК, яка містить реплікаційні петлі, що дозволяє виявити місце розташування і переміщення реплікативних вилок та нанести їх на карту, використовуючи ділянки денатурації як точки відліку. За допомогою цієї методики було виявлено, що утворення реплікаційних петель завжди розпочинається у певній точці, яку назвали точкою початку реплікації (англ. - origin). Цим самим було також підтверджено попереднє спостереження про те, що реплікація відбувається у двох напрямках. У кільцевих молекулах ДНК дві реплікативні вилки зустрічаються у точці на стороні кільця, протилежній до точки початку реплікації. Тепер специфічні точки початку реплікації ідентифіковано і охарактеризовано у бактерій та нижчих еукаріотів.

Синтез ДНК відбувається напівперервно у напрямку 5'→3'. Новий ланцюг ДНК завжди синтезується у напрямку 5’→3’, а вільна група 3'-ОН слугує точкою елонгації (тобто подовження) ДНК (визначення 5'- та 3'-кінців ланцюга ДНК навідстаюо на Рис. 8-7). Оскільки два ланцюги ДНК антипаралельні, то ланцюг, що виконує роль матриці, зчитується у напрямку від 3'- кінця до 5'-кінця.

Однак виникає запитання: якщо синтез ДНК завжди йде у напрямку 5’3’, то як можуть обидва ланцюги синтезуватися одночасно? Якби два ланцюги синтезувалися послідовно під час руху реплікативної вилки, то синтез одного з них повинен був би йти в напрямку 3’5’. Це питання було з’ясоване Рейджі Оказакі зі співробітниками у 1960 р. Вони виявили, що один з нових ланцюгів ДНК синтезується у вигляді коротких відрізків, які тепер називають фраґментами Оказакі. Врешті ця робота дозволила дійти однозначного висновку про те, що один ланцюг ДНК синтезується безперервно, у той час як синтез іншого ланцюга переривається (Рис. 25-4). Синтез безперервного, або ведучого ланцюга (інша назва – лідерного ланцюга) проходить у 5’3’ напрямку, тобто у тому ж напрямку, в якому рухається реплікативна вилка. Синтез перервного, або відстаючого ланцюга також відбувається у 5’3’ напрямку, але протилежно до напрямку руху реплікативної вилки. Довжина фраґментів Оказакі залежно від типу клітини коливається в межах від декількох сотень до декількох тисяч нуклеотидів. Як ми побачимо пізніше, синтез ведучого і відстаючого ланцюгів чітко скоординований.

Деґрадацію ДНК здійснюють нуклеази

Для того, щоб краще зрозуміти ензимологію процесу реплікації ДНК, спочатку розглянемо ензими, які не синтезують, а розщеплюють цю макромолекулу. Такі ензими називають нуклеазами, або ДНКазами, якщо вони проявляють специфічність до ДНК, а не до РНК. Кожна клітина містить кілька різних типів нуклеаз, що належать до двох великих класів: екзонуклеаз та ендонуклеаз. Екзонуклеази розщеплюють нуклеїнові кислоти з одного кінця молекули. Багато з них функціонують лише в 5’3’ чи 3’5’ напрямку, видаляючи нуклеотиди відповідно тільки з 5’- чи 3’-кінця одного ланцюга подвійноланцюгової нуклеїнової кислоти, чи одноланцюгової молекули ДНК. Ендонуклеази починають розщеплювати ланцюг чи молекулу нуклеїнової кислоти у специфічних внутрішніх ділянках, поступово утворюючи все менші й менші фраґменти. Деякі екзо- і ендонуклеази розщеплюють лише одноланцюгові ДНК. Існує кілька важливих класів ендонуклеаз, які розщеплюють лише специфічні послідовності нуклеотидів (наприклад, рестрикційні ендонуклеази, що використовуються у біотехнології; див. розділ 9, Рис. 9-3). У цьому та наступних підрозділах ми ще не раз зустрінемося з різними типами нуклеаз.

Синтез ДНК здійснюють ДНК-полімерази

Пошук ензиму, здатного синтезувати ДНК, розпочався 1955 р., коли Артур Корнберґ зі співробітниками виділили і охарактеризували ДНК-полімеразу з клітин E. сoli. Тепер цей ензим, який складається з одного поліпептиду, називають ДНК-полімеразою I (М_r 103000; кодує її ген polA). Набагато пізніше дослідники виявили, що E. сoli містить щонайменше ще чотири різних ДНК-полімерази, які описані нижче.

Детальне вивчення ДНК-полімерази I виявило характерні особливості процесу синтезу ДНК, які, як тепер встановлено, спільні для всіх полімераз. Головною реакцією цього процесу є перенесення фосфорильної групи. Нуклеофілом виступає 3’-гідроксильна група нуклеотиду, розташованого на 3'-кінці ланцюга, що синтезується. Дія нуклеофіла направлена на атом -фосфору приєднуваного дезоксинуклеозид-5'-трифосфату (Рис.25-5). Внаслідок реакції вивільняється неорґанічний пірофосфат. Рівняння реакції:

(dNМР)_n + dNТР  (dNМР)_n+1 + PP_i (25-1),

ДНК Подовжена ДНК

де dNМР і dNТР, відповідно, дезоксинуклеозид-5’-монофосфат і дезоксинуклеозид-5’-трифосфат. Реакція, очевидно, супроводжується лише мінімальною зміною вільної енерґії, оскільки один фосфодіефірний зв”язок утворюється за рахуном використання дещо менш стабільного фосфатного ангідриду. Додаткову стабілізацію синтезованої ДНК порівняно з вільними нуклеотидами забезпечують нековалентні взаємодії, що виникають під час спаровування та упаковування азотистих основ у стопки. Отже, утворення продуктів реакції в клітині полегшується за рахунок енергії, що вивільняється внаслідок гідролізу пірофосфату ензимом пірофосфатазою, величина її складає 19 кДж/моль.

Перші дослідження функціонування ДНК-полімерази I виявили дві необхідні умови для забезпечення полімеризації ДНК. По-перше, всі ДНК-полімерази потребують матриці. Реакція полімеризації регулюється матричним ланцюгом ДНК згідно правил спаровування основ, запропонованих Вотсоном і Кріком: там, де у матриці міститься ґуанін, до нового ланцюга приєднується дезоксинуклеотид цитозину, і т.д. Це відкриття особливо важливе не лише тому, що воно забезпечує хімічну основу для точної напівконсервативної реплікації ДНК, але й тому, що це був перший приклад використання матриці для спрямування біосинтетичної реакції.

По-друге, для функціонування полімераз необхідний праймер, тобто затравка. Праймер - це сеґмент ланцюга (комплементарний до матриці) з вільною 3’-гідроксильною групою, до якої можуть приєднуватися нуклеотиди; вільний 3’-кінець праймера називається кінцем праймера (primer terminus). Іншими словами, частина нового ланцюга вже повинна існувати: всі ДНК-полімерази можуть лише додавати нуклеотиди до уже наявного ланцюга. Зазвичай більшість праймерів – це оліґонуклеотиди РНК, а не ДНК, синтезуються вони по мірі необхідності за допомогою спеціалізованих ензимів.

Після приєднання нуклеотиду до нарощуваного ланцюга ДНК-полімераза або відокремлюється (дисоціює) від матриці, або ж рухається вздовж неї і приєднує інший нуклеотид. Від’єднання і повторне приєднання ДНК-полімерази можуть обмежувати загальну швидкість реакції полімеризації, оскільки процес відбувається швидше, якщо полімераза додає нуклеотиди без від'єднання від матриці. Середня кількість приєднаних нуклеотидів перед дисоціацією полімерази визначає її продуктивність (англ. - processivity). ДНК-полімерази можуть суттєво відрізнятися за цим показником, деякі з них приєднують лише декілька нуклеотидів перед дисоціацією від матриці, інші ж – тисячі нуклеотидів.  Полімеризація нуклеотидів ДНК-полімеразою

Реплікація ДНК – надзвичайно точний процес

Процес реплікації ДНК відбувається з дуже високим ступенем точності. Наприклад, у клітинах E. сoli помилки трапляються лише один раз на 10⁹ - 10¹⁰ приєднаних нуклеотидів; оскільки до складу хромосоми E. сoli входить 4.6 х 10⁶ п.о., то це означає, що помилка може трапитися один раз на 1 000 - 10 000 реакцій реплікації. Розрізнити “правильний” нуклеотид від “неправильного” в процесі полімеризації ДНК допомагають не лише водневі зв”язки, які забезпечують правильне спаровування комплементарних основ, але й загальна геометрія стандартних пар основ А=Т та C≡G (Рис. 25-6). Активний центр ДНК-полімерази I пристосований лише для пар основ з такою ґеометрією. Неправильні нуклеотиди можуть утворити водневі зв”язки із основами матриці, але їхня геометрія не дозволить їм відповідно розташуватися в активному центрі, а тому вони будуть видалені ще до утворення фосфодіефірних зв”язків.

Саме по собі правильне спаровування основ у реакції полімеризації не достатнє для досягнення високого ступеня точності процесу реплікації. Дослідження in vitro показали, що на кожні 10⁴ - 10⁵ правильних нуклеотидів ДНК-полімерази включають один неправильний нуклеотид. Такі помилкові спаровування час від часу трапляються через те, що азотиста основа впродовж нетривалого періоду часу може перебувати у незвичній таутомерній формі (див. Рис. 8-9) і утворювати водневий зв”язок із невідповідним партнером. Можливість такої помилки in vivo зменшується завдяки існуванню додаткових ензиматичних механізмів.

Одним із таких механізмів, властивим практично всім ДНК-полімеразам, є наявність у них 3’5’-екзонуклеазної активності , яка забезпечує подвійну перевірку кожного з уже приєднаних нуклеотидів. Така нуклеазна активність зумовлює здатність ензиму видаляти щойно приєднаний нуклеотид і характеризується високою специфічністю щодо некомплементарно спарованих основ (Рис. 25-7). Якщо полімераза приєднала неправильний нуклеотид, то інгібується транслокація (тобто переміщення) ензиму до місця приєднання наступного нуклеотиду, і ця пауза використовується для виправлення помилки. Завдяки 3’5’- екзонуклеазній активності некоиплементарний нуклеотид видаляється, а полімеразна реакція починається знову. Таку активність ензиму називають коригувальною (англ. - proofreading), вона не є просто зворотною полімеразною реакцією (рівняння 25-1), оскільки в ній не бере участь пірофосфат. Полімеразну та коригувальну активності ДНК-полімерази можна виміряти окремо одну від одної. Коригування у 10²-10³ разів підвищує точність реакції полімеризації. У мономерній молекулі ДНК-полімерази I полімеризуюча і коригувальна активності локалізовані у різних активних центрах одного поліпептида.

Завдяки поєднанню процесів відбору основ і коригування ДНК-полімераза робить тільки одну помилку на кожні 10⁶-10⁸ приєднаних основ. Однак насправді точність реплікації у клітинах E. сoli ще вища. Її забезпечує окрема ензимна система, яка виправляє некомплементарно підібрані пари основ уже після реплікації. Цей процес буде описано разом з іншими реакціями репарації ДНК у підрозділі 25.2.

У клітинах E. сoli функціонує щонайменше п’ять ДНК-полімераз

Понад 90% ДНК-полімеразної активності, наявної в екстракті з клітин E. сoli, належить ДНК-полімеразі I. Однак зразу ж після виділення цього ензиму в 1955 р. почали накопичуватися факти про те, що він не здатний забезпечити реплікацію великої хромосоми E. сoli. Ці факти полягали в наступному: (1) швидкість приєднання нуклеотидів (600 нуклеотидів/хв.) менша (у 100 і більше разів), ніж швидкість руху реплікативної вилки у бактеріальній клітині; (2) ДНК-полімеразі I властива відносно низька продуктивність; (3) як показали ґенетичні дослідження, у процесі реплікації задіяно багато ґенів, а отже, і протеїнів, тому очевидно, що ДНК-полімераза І функціонує не одна; (4) і найважливіше: 1969 р. Джон Кернс виділив штам бактерій з мутантним ґеном ДНК-полімерази I, який кодував неактивний ензим; хоча цей штам мав незвичайно високу чутливість до чинників, які пошкоджували ДНК, він все ж таки був життєздатним!

Подальший пошук інших ДНК-полімераз привів на початку 1970-х рр. до відкриття наявності у клітинах E. сoli ДНК-полімерази II і ДНК-полімерази III. ДНК-полімераза II – це ензим, що бере участь у репарації ДНК (підрозділ 25.3), а ДНК-полімераза III – головний реплікативний ензим E. сoli. Властивості трьох ДНК-полімераз порівняно у таблиці 25-1. Ідентифіковані 1999 р ДНК полімерази IV та V задіяні в особливій формі процесу репарації ДНК (підрозділ 25.2).

ДНК-полімераза I не є головним реплікативним ензимом, натомість під час процесів реплікації, рекомбінації і репарації вона виконує функції «прибиральника». Специфічні функції цього ензиму підсилює наявність 5’3’-екзонуклеазної активності. Така активність відмінна від активності 3’5’-коригувальної екзонуклеази (Рис. 25-7), вона локалізована у структурному домені, який можна відокремити від ензиму м’якою обробкою протеазою. Після видалення 5’3’-екзонуклеазного домена, залишається фраґмент (М_r. 68 000), який називають великим фраґментом, або фраґментом Кленова (Рис.25- 8), що зберігає полімеризуючу і коригувальну активності. Завдяки 5’3’ - екзонуклеазній активності ДНК-полімераза I може замінити сеґмент ДНК (чи РНК), спарований з матричним ланцюгом, цей процес називають нік-трансляцією (англ. nick – розріз чи розрив, нік-трансляція – зміщення розриву, рис. 25-9). Більшості інших ДНК-полімераз не властива 5’3’ - екзонуклеазна активність.

Будова ДНК-полімерази III набагато складніша, ніж ДНК-полімерази I; вона містить 10 типів субодиниць (Табл. 25-2). Полімеризуюча і коригувальна активності локалізовані, відповідно, в субодиницях  та  (епсилон). Субодиниця  зв’язується з субодиницями  та  і разом вони формують осердя ензиму, яке здатне полімеризувати ДНК, але з обмеженою продуктивністю. Два осердя полімерази зв”язуються за допомогою іншої групи субодиниць - -комплексу (його називають «комплекс, що завантажує фіксатор», англ. clamp-loading complex), який складається із п’яти субодиниць чотирьох різних типів - ₂’. Зв’язування осердь полімерази відбувається через субодиниці  (тау). До комплексу приєднуються дві додаткові субодиниці -  (хі) і  (псі). Такий ансамбль із 13 протеїнових субодиниць (дев”ять з них належать до різних типів) і називають ДНК-полімеразою III^* (Рис. 25-10а).

ДНК-полімераза III^* може полімеризувати ДНК, але з набагато нижчою продуктивністю, ніж можна було б очікувати, зважаючи на організовану реплікацію цілої хромосоми. Необхідне збільшення продуктивності забезпечують додаткові -субодиниці, чотири з яких складають голоензим ДНК-полімерази III. -Субодиниці з’єднуються в пари, утворюючи кільцеві структури, що оточують ДНК і діють як фіксатори (Рисунок 25-10б). Кожен димер асоційований з осердям полімерази III (один димерний фіксатор на одне осердя) і у процесі реплікації ковзає вздовж молекули ДНК. Завдяки такому ковзанню -фіксатор запобігає дисоціації ДНК-полімерази ІІІ від ДНК і більш ніж у 500 000 разів підвищує продуктивність ензиму (Табл.25-1).

У реплікації ДНК беруть участь багато ензимів та протеїнових факторів

У процесі реплікації в клітинах E. сoli беруть участь не лише ДНК-полімерази, але ще 20 чи й більше різних ензимів та протеїнів, кожен з яких виконує специфічну функцію. У цілому цей комплекс називають ДНК -репліказною системою, або реплісомою. Велика кількість задіяних ензимів зумовлена складністю структури ДНК та необхідністю забезпечення точності реплікації. Нижче охарактеризуємо головні класи ензимів реплікації з точки зору функцій, які вони виконують.

Для того, щоб ланцюги ДНК могли функціонувати у ролі матриць і бути доступними для полімераз, вони повинні розплестися. Цей процес забезпечують ензими гелікази, які переміщаються вздовж ДНК і відокремлюють ланцюги один від одного, використовуючи для цього енергію АТР. Розплітання ланцюгів спричиняє топологічний стрес у спіральній структурі ДНК (див. Рис. 24-12), уникнути якого допомагають ензими топоізомерази. Стабілізують роз”єднані ланцюги ДНК-зв”язувальні протеїни. Як було вже зазначемо вище, перед початком синтезу ДНК полімеразами до матриці повинні приєднатися праймери - короткі сеґменти РНК, які синтезують ензими праймази. У кінці процесу праймерні РНК видаляються і заміщуються на ДНК; у клітинах E. сoli цю функцію, поряд з багатьма іншими, виконує ДНК-полімераза I. Після видалення РНК-праймера і заповнення проміжку в ДНК, у її каркасі залишається розрив за рахунок розщепленого фосфодіефірного зв”язку. Зшивають такі розриви ензими ДНК-ліґази. Очевидно, що всі описані процеси повинні бути скоординовані і відрегульовані, найкраще ці взаємодії охарактеризовано для реплікативної системи E. coli.

Реплікація хромосоми E. сoli відбувається упродовж декількох стадій

Процес синтезу молекули ДНК можна розділити на три стадії: ініціації, елонґації і термінації, які розрізняються як за місцем протікання реакцій, так і за ензимами, що їх каталізують. З матеріалу, навідстаюого у цьому та двох наступних розділах ви довідаєтеся, що синтез головних інформаційно насичених біологічних полімерів – ДНК, РНК та протеїнів - можна зрозуміти з точки зору цих же трьох стадій, кожній з яких притаманні свої унікальні характеристики. Описані нижче процеси грунтуються на інформації, отриманій в експериментах in vitro з очищеними протеїнами E. coli, хоча механізми, за якими вони відбуваються, висококонсервативні і властиві всім реплікативним системам.

Ініціація. Ділянка ДНК, де починається реплікація ДНК у E. сoli (її називають oriC, або точкою початку реплікації) складається з 245 п.о. і містить висококонсервативні елементи, характерні для всіх бактеріальних точок початку реплікації. Загалом розташування консервативних послідовностей проілюстровано на рис. 25-11. Серед них головними послідовностями є дві групи коротких повторів: три повтори послідовності довжиною 13 п.о. і чотири повтори послідовності довжиною 9 п.о.

У реакціях, що відбуваються на стадії ініціації реплікації, беруть участь щонайменше дев”ять різних ензимів або протеїнів (узагальнені у Таблиці 25-3). Вони розкручують спіраль ДНК у точці початку реплікації і утворюють передпраймерний комплекс для подальших реакцій. Головну роль у процесі ініціації відіграє протеїн DnaA. Комплекс з чотирьох-п'яти молекул протеїну DnaA зв”язується у точці початку реплікації з чотирма повторами послідовності з 9 п.о. (Рис. 25-12, етап ), а далі розпізнає і послідовно денатурує ДНК у ділянці трьох повторів по 13 п.о., збагачених парами А=Т (етап ). Цей процес потребує участі АТР і бактеріального гістоноподібного протеїну HU. Після цього протеїн DnaС «навантажує» на розплетену ділянку протеїн DnaВ. Молекули цього протеїну утворюють два кільцеподібні гексамери, кожен з яких приєднується до одного з ланцюгів ДНК і діє як геліказа, розплітаючи ДНК в обох напрямках і утворюючи дві ймовірні реплікативні вилки. Якщо тепер в умовах in vitro додати протеїн з клітин E. сoli, здатний зв”язуватися з одноланцюговою ДНК (SSB) і ДНК-ґіразу (ДНК-топоізомеразу II), то геліказа DnaB, просуваючись від точки початку реплікації, здатна швидко розплести тисячі пар основ. Для стабілізації роз”єднаних ланцюгів і попередження ренатурації, з одноланцюговою ДНК одночасно зв”язується багато молекул SSB, а ензим ґіраза зменшує топологічний стрес, викликаний DnaB-геліказою. Якщо при цьому в систему in vitro ввести додаткові реплікаційні протеїни, то опосередкований DnaB процес розплітання ланцюгів ДНК поєднується з процесом реплікації, як описано нижче.

Ініціація - єдина фаза реплікації ДНК, яка реґулюється, причому у такий спосіб, що процес реплікації відбувається тільки один раз упродовж кожного клітинного циклу. Механізм реґуляції поки що повністю не з’ясовано, хоча ґенетичні та біохімічні дослідження надають певні ідеї щодо того, як це може відбуватися.

На час початку фази ініціації реплікації впливає метилювання ДНК і взаємодія з бактеріальною плазматичною мембраною. Dam-метилаза метилює N⁶-положення аденіну всередині паліндромної послідовності (5’)GATC у ділянці oriC (Таблиця 25-3) (Dam – це не біохімічний термін, а скорочення від слів DNA adenine mеthylation, що означає метилювання аденіну у складі ДНК). Ділянка oriC в E. сoli суттєво збагачена послідовністю GATC: на 245 п.о. цієї ділянки припадає 11 таких послідовностей, тоді як середня частота GATC загалом у хромосомі E. сoli складає 1 послідовність на 256 п.о.

Відразу ж після реплікації ДНК перебуває у напівметильованому стані: oriC у складі батьківських ланцюгів метильована, а у новосинтезованих ланцюгах – ні. Напівметильовані послідовності oriC на певний час ізолюються шляхом взаємодії з плазматичною мембраною (за невідомим механізмом). Згодом oriC відділяється від плазматичної мембрани, повністю метилюється Dam-метилазою і знову може зв”язувати DnaA. Реґуляція ініціації реплікації також включає повільний гідроліз ATP протеїном DnaA, який почергово, з періодом у 20-40 хвилин, переходить з активної (зв”язаною з ATP) у неактивну (зв”язану з АДФ) форму, і навпаки.

Елонґація Фаза елонґації реплікації включає два різні, але споріднені процеси: синтез ведучого ланцюга і синтез відстаючого ланцюга. У синтезі обох ланцюгів важливу роль відіграють декілька ензимів, що функціонують у реплікативній вилці. Спочатку ДНК-гелікази розплітають батьківську ДНК, а виникаючий внаслідок цього топологічний стрес послаблюють топоізомерази. Потім кожний розділений ланцюг стабілізують SSВ. З цього моменту синтез ведучого і відстаючого ланцюгів відбувається зовсім різними шляхами.

Синтез ведучого ланцюга розпочинається із синтезу ензимом праймазою (протеїн DnaG) у точці початку реплікації короткого (10-60 нуклеотидів) праймера РНК, до якого ДНК-полімераза IIІ приєднує дезоксирибонуклеотиди. Далі синтез ведучого ланцюга продовжується безперервно відповідно до швидкості розплітання ДНК у реплікативній вилці.

Синтез відстаючого ланцюга, як уже згадувалося, відбувається шляхом утворення коротких фраґментів Оказакі. Спочатку, як і у разі синтезу ведучого ланцюга, праймаза синтезує РНК-праймер, а ДНК-полімераза III зв”язується з ним і приєднує дезоксирибонуклеотиди (Рис. 25-13). На цьому рівні синтез кожного фраґменту Оказакі виглядає простим, хоча насправді це досить складний процес. Його складність полягає у координації синтезу ведучого і відстаючого ланцюгів: обидва ланцюги синтезуються одним асиметричним димером ДНК-полімерази III, що забезпечується утворенням петлі на відстаючому ланцюзі, як це показано на Рисунку 25-14, внаслідок чого дві точки полімеризації зближуються одна з одною.

Синтез фраґментів Оказакі на відстаючому ланцюзі є прикладом елеґантної ензиматичної «хореографії». Геліказа DnaB і праймаза DnaG-складають функціональну одиницю всередині реплікаційного комплексу, який називають праймосомою. Для безперервного синтезу ведучого ланцюга ДНК-полімераза III використовує один набір своїх субодиниць (осердя полімерази), водночас інший набір субодиниць осердя циклює від одного фраґмента Оказакі до наступного, що синтезуються на петлеподібному відстаючому ланцюзі. Переміщаючись вздовж відстаючого ланцюга матриці у напрямку 5'→3', геліказа DnaB розплітає ДНК у ділянці реплікативної вилки (Рисунок 25-14а). ДНК-праймаза час від часу звязується з DnaB-геліказою і синтезує короткий РНК-праймер (Рисунок 25-14б). Після цього новий ковзаючий - фіксатор розташовується у ділянці праймера за допомогою -комплексу ДНК-полімерази III (Рис. 25-14в). Після завершення синтезу фраґмента Оказакі процес реплікації зупиняється і субодниниці осердя ДНК-полімерази III дисоціюють від  -фіксатора (і від завершеного фраґмента Оказакі) та зв’язуються з новим фіксатором (Рис. 25-14г, ґ). Це ініціює синтез нового фраґмента Оказакі. Як вказувалося раніше, весь комплекс протеїнів, відповідальний за координований синтез ДНК у реплікативній вилці, називають реплісомою. Склад протеїнів, що функціонують на цьому етапі, наведено у таблиці 25-4.

Реплісома забезпечує швидкий синтез ДНК, додаючи ~ 1000 нуклеотидів/с до обох ланцюгів (ведучого і відстаючого). Після завершення синтезу фраґмента Оказакі, його РНК-праймер видаляється і заміщується на ДНК під дією ДНК-полімерази I, а розрив зшивається ДНК-ліґазою (Рисунок 25-15).

ДНК-лігаза каталізує утворення фосфодіефірного зв”язку між 3’-гідроксилом на кінці одного ланцюга і 5’-фосфатом на кінці іншого ланцюга ДНК. Для цієї реакції фосфат активується шляхом аденилілування. ДНК-лігаза, виділена з вірусів і еукаріотів, з цією метою використовує ATP, натомість ДНК, виділена з бактерій, як джерело AMP-активуючої групи (рис.25-16) використовує NAD⁺ - кофактор, що зазвичай функціонує у реакціях перенесення гідрид-іонів (див. Рис. 13-15). Інший ензим метаболізму ДНК, ДНК-лігаза, виявився важливим реаґентом для експериментів з рекомбінантними ДНК (Див Рис. 9-1).

Термінація. Врешті решт дві реплікативні вилки кільцевої хромосоми E.сoli зустрічаються на кінцевій ділянці, що містить численні копії послідовності із 20 п.о., яку називають Ter (від terminus- кінець) (Рис. 25-17а). Ter-послідовності упорядковані у хромосомі у вигляді пастки, в яку реплікативна вилка може ввійти, але не може з неї вийти. Вони слугують місцями зв”язування для протеїнів, що мають назву Tus ( від англ. terminus utilization substance – речовина, яка утилізує кінці). Комплекс Tus-Ter здатний зупинити реплікативну вилку, що рухається лише в одному напрямку. У кожному циклі реплікації може функціонувати лише один такий комплекс - той, який першим зустрінеться на шляху тієї чи іншої реплікативної вилки. Вважають, що протилежно спрямовані реплікативні вилки, зустрівшись одна з одною, у більшості випадків зупиняються, а послідовності Ter, хоча і не видаютъся дуже важливими, проте здатні запобігти надлишковій реплікації за участю однієї реплікативної вилки у випадку, якщо інша запізнюється чи призупинена внаслідок ушкодження ДНК, або за якихось інших обставин.

Отже, коли одна реплікативна вилка зустрічається із функціональним комплексом Tus-Ter, вона зупиняється; натрапивши на цю (зупинену) вилку зупиняється і друга вилка. Далі реплікуються кінцеві декілька сотень пар основ ДНК, розташовані між цими великими протеїновими комплексами (механізм їхньої реплікації ще не з’ясовано) і утворюються дві топологічно взаємозв”язані (зачеплені) кільцеві хромосоми (Рис. 25-17б). З”єднані таким способом кільцеві ДНК називають катенанами (від англ. сatenate – зчеплювати, з’єднувати) . Роз”єднання зачеплених кілець у E. сoli виконує топоізомераза IV ( топоізомераза типу II). Під час поділу клітини роз”єднані хромосоми переходять в дочірні клітини. Подібним чином протікає термінальна фаза реплікації інших кільцевих хромосом, у тому числі і багатьох вірусних ДНК, здатних інфікувати еукаріотичні клітини.

У бактерій реплікація відбувається у зв'язаних з мембраною «реплікаційних фабриках»

Процес реплікації кільцевої бактеріальної хромосоми відзначається високою упорядкованістю. Якщо у точці початку реплікації відбулася ініціація реплікації у двох напрямках, то це не означає, що дві реплісоми переміщатимуться у протилежних напрямках уздовж нитки ДНК. Натомість вони з’єднуються разом і приєднуються до однієї точки на внутрішній мембрані, а ДНК-субстрат протягується крізь цю так звану "реплікаційну фабрику" (Рис. 25-18а). Точка приєднання до мембрани розміщується в центрі видовженої бактеріальної клітини. Після ініціації новоутворені точки початку реплікації розподіляються між половинками клітини,а утворювані внаслідок реплікації нові хромосоми виштовхуються кожна в свою половину (Рис. 25-18б). Складна просторова орґанізація новосинтезованої хромосоми підтримується за допомогою багатьох протеїнів, зокрема, бактеріальних гомологів SMC-протеїнів і топоізомераз (Розділ 24). Після завершення реплікації наступає поділ клітини, у процесі якого розведені в різні половини вихідної клітини хромосоми точно розподіляються між дочірніми клітинами. Якщо реплікація відбувається у дочірніх клітинах, то точка початку реплікації входить до складу нових «реплікаційних фабрик», які формуються на мембрані в центрі клітини, і весь процес повторюється.

В еукаріотичних клітинах реплікація відбувається набагато складніше

Молекули ДНК в еукаріотичних клітинах значно більшого розміру, ніж у бактерій, і організовані у складні нуклеопротеїнові структури (хроматин; стр. ). Головні особливості процесу реплікації ДНК однакові як в еукаріотичних, так і у прокаріотичних клітинах; збереглися упродовж еволюції також функції і структура багатьох протеїнових комплексів. Однак деякі цікаві варіації наведених вище загальних принципів дають підстави для нового погляду на процес реґуляції реплікації та її взаємозв”язок із клітинним циклом.

Точки початку реплікації, які називають послідовностями, що реплікуються автономно (ARS, від англ. autonomously rerplicating sequences), або реплікаторами, ідентифіковані і найкраще вивчені у клітинах дріжджів. До складу реплікаторів у цих клітинах входить ~150 п.о., упорядкованих у декілька важливих консервативних послідовностей. У гаплоїдному ґеномі дріжджів близько 400 реплікаторів розподілені у 16 хромосомах. У всіх еукаріотів для ініціації реплікації необхідний мультисубодиничний протеїн, який має назву “комплекс розпізнавання точки початку реплікації”, або ORC (від англ. origin recognition complex). Цей комплекс зв’язується з декількома послідовностями всередині реплікатора, а також взаємодіє з багатьма іншими протеїнами, що беруть участь у контролі еукаріотичного клітинного циклу, та реґулюється ними. Здатність зв’язуватися з ORC мають два інші протеїни, а саме згадуваний вище ензим CDC6, відкритий при досліджені ґенів, що впливають на цикл поділу клітин (назва походить від англ. cell division cycle) і CDT1 (від англ. Cdc10-dependent transcript І, тобто Cdc10-залежний транскрипт 1). Після зв’язування з ORC ці протеїни опосередковують утворення гетерогексамеру з протеїнів стабілізації мініхромосом (МСМ2 - МСМ7; абревіатура походить від англ. minichromosome maintenance proteins). Комплекс МСМ - це кільцеподібна реплікативна геліказа, аналоґічна бактеріальній геліказі DnaB. Функція протеїнів CDC6 і CDT1 подібна до функції бактеріального протеїну DnaC; вони “завантажують” МСМ-геліказу на ДНК біля точки початку реплікації.

Швидкість руху реплікативної вилки у клітинах еукаріотів (~ 50 нуклеотидів/с) складає лише 1/20 від цього показника у E. coli. За такої швидкості реплікація хромосоми людини, яка починалася б в одній точці, у середньому тривала б понад 500 год. Насправді ж реплікація хромосоми людини починається з численних точок, розташованих одна від одної на відстані 30 000 - 300 000 п.о., і відбувається в обох напрямках. Еукаріотичні хромосоми набагато більші за бактеріальні, тому можливо, що наявність численних точок початку реплікації є характерною універсальною властивістю клітин еукаріотів.

Подібно до бактерій, еукаріотичні клітини містять кілька типів ДНК-полімераз. Деякі з них виконують специфічні функції, наприклад, забезпечують реплікацію мітохондріальної ДНК. Для реплікації ядерних хромосом необхідна участь ДНК-полімерази  у поєднанні з ДНК-полімеразою . ДНК-полімераза  - це типовий мультисубодиничний ензим, структура і властивості якого подібні у всіх еукаріотичних клітинах. Одна з субодиниць має праймазну активність, а найбільшій субодиниці (М_r ~ 180 000) притаманна полімеризуюча активність. Одначе ця полімераза не виявляє коригувальної 3’5’- екзонуклеазної активності, а отже, не може забезпечити високу точність реплікації ДНК. Вважають, що ДНК-полімераза  бере участь лише у синтезі коротких праймерів (РНК чи ДНК) для фраґментів Оказакі, що синтезуються на відстаючому ланцюзі. Ці праймери згодом нарощує мультисубодинична ДНК-полімераза . Цей ензим зв’язується і стимулюється протеїном PCNA (від aнгл. proliferating cell nuclear antigen – ядерний антиґен проліферуючих клітин, М_r 29 000), що у великій кількості міститься в ядрі проліферуючих клітин. Тривимірна структура PCNA дуже подібна до структури -субодиниці ДНК-полімерази III E. сoli (Рис. 25-10б), хоча гомолоґія їхніх первинних послідовностей і не доказана. Функція протеїну PCNA також подібна до функції β-субодиниці: він формує кільцеві фіксатори, які значно підвищують продуктивність полімерази. ДНК-полімеразі  притаманна 3’5’ - коригувальна екзонуклеазна активність; вона, мабуть, здійснює синтез і ведучого, і відстаючого ланцюгів у складі комплексу, аналоґічного димерній бактеріальній ДНК-полімеразі III.

У деяких випадках, наприклад, при репарації ДНК, ДНК-полімеразу  замінює ДНК-полімераза  . Цей ензим може також функціонувати у реплікативній вилці, відіграючи роль, аналогічну бактеріальній ДНК-полімеразі I, тобто видаляючи праймери фраґментів Оказакі у процесі реплікації відстаючого ланцюга.

Численні ДНК-віруси кодують свої власні ДНК-полімерази, і саме вони є мішенями для дії деяких фармацевтичних препаратів. Наприклад, активність ДНК-полімерази віруса простого герпесу інгібує препарат ацикловір, розроблений Ґертрудою Еліон (стр. ). Ацикловір містить ґуанін, приєднаний до неповного кільця рибози. Він фосфорилюється кодованою вірусом тимідинкіназою, причому його спорідненість до вірусного ензиму у 200 разів вища, ніж до тимідинкінази клітини-хазяїна. Тому фосфорилювання відбувається, головним чином, лише в інфікованих вірусами клітинах. Утворений ацикло-GMP під дією клітинних кіназ перетворюється на ацикло-GTP, який одночасно виступає і інгібітором, і субстратом ДНК-полімераз, і який більшою мірою конкурентно інгібує ДНК-полімеразу герпеса, ніж полімерази клітини. Унаслідок відсутності 3'-гідроксильної групи, ацикло-ҐТФ, у разі його включення у молекулу ДНК, здатний діяти також як термінатор синтезу ланцюга. Отже, реплікація віруса ацикловіром гальмується на різних етапах.

(ФОРМУЛА) Ацикловір

У процесі реплікації еукаріотичної ДНК задіяні також ще два протеїнові комплекси. Протеїн RPA (від англ. replication protein A, тобто реплікаційний протеїн А) належить до ДНК-зв”язувальних протеїнів, які специфічні до одноланцюгових еукаріотичних ДНК, функції його аналогічні SSВ-протеїну E. coli. Протеїн RFC (від англ. replication factor C, тобто реплікаційний фактор С) слугує фіксатором для PCNA і полегшує збирання активних реплікаційних комплексів. Послідовність субодиниць комплексу RFC дуже подібна до послідовності субодиниць γ- комплексу бактерій.

Процес термінації реплікації лінійних еукаріотичних хромосом включає синтез на їхніх краях спеціальних структур, названих теломерами, що детальніше обговорюватиметься у наступному розділі.

Підсумок 25.1 Реплікація ДНК

■ Реплікація ДНК відбувається з дуже високою точністю у визначений час клітинного циклу напівконсервативним способом; кожний ланцюг слугує матрицею для нового дочірнього ланцюга. Процес реплікації складається із трьох окремих фаз: ініціації, елонґації і термінації. Реакція починається у точці початку реплікації і, як правило, протікає у двох напрямках.

■ Синтез ДНК здійснюють ДНК-полімерази у напрямку 5'→3'. У реплікативній вилці ведучий ланцюг синтезується безперервно у тому ж напрямку, у якому рухається вилка, а відстаючий ланцюг синтезується перервно у вигляді фраґментів Оказакі, які у подальшому піддаються лігування.

■ Точність реплікації ДНК підтримується завдяки: (1) відбору полімеразою азотистих основ; (2) наявності у більшості ДНК-полімераз коригувальної 3'→5'- ендонуклеазної активності; (3) наявності специфічних систем репарації помилок, які залишаються після реплікації.

■ Більшість клітин містить кілька типів ДНК-полімераз. В E. coli головним реплікативним ензимом є ДНК-полімераза ІІІ. ДНК-полімераза І виконує специфічні функції під час реплікації, рекомбінації і репарації.

■ У процесі реплікації хромосоми E. coli задіяно багато ензимів і протеїнових факторів, орґанізованих у “реплікаційні фабрики”, в яких матрична ДНК закручена навколо двох реплісом, приєднаних до бактеріальної плазматичної мембрани.

■ Реплікація у клітинах еукаріотів відбувається подібним способом, однак еукаріотичні хромосоми містять багато точок початку реплікації.