25.2 Репарація днк
Зазвичай клітини містять один або два набори ґеномної ДНК. У разі ушкоджень молекули протеїнів і РНК можуть швидко заміщуватися шляхом використання інформації, закодованої в ДНК, але молекули ДНК за таких умов самі себе замінити не можуть. Тому збереження цілісності інформації, що міститься в ДНК, життєво важливе для клітини і забезпечується завдяки існуванню систем виправлення ушкоджень ДНК, або систем репарації. Ушкодження у молекулі ДНК можуть виникати внаслідок різноманітних процесів, деякі з них відбуваються спонтанно, а інші індукуються чинниками середовища (Розділ 8). Іноді до пошкодження інформаційного вмісту ДНК може призвести сам процес реплікації, якщо до складу новосинтезованої молекули включаться некомплементарні пари основ (наприклад, G з’єднаний з Т).
Хімічні механізми ушкодження ДНК різноманітні і складні. У відповіді клітин на ці ушкодження задіяні численні ензиматичні системи, які каталізують деякі дуже цікаві хімічні перетворення у процесі метаболізму ДНК. У цьому підрозділі ми спочатку опишемо ефекти, викликані змінами у послідовності нуклеотидів ДНК, а потім розглянемо специфічні системи репарації ДНК.
Мутації, пов”язані з раковими захворюваннями
Найкращим підходом, який ілюструє важливість процесу репарації ДНК, є дослідження впливу невиправлених ушкоджень її молекули. До серйозних наслідків призводить зміна послідовності основ у ДНК, яка у разі реплікації і перенесення до наступних поколінь клітин стає постійною. Таку постійну (успадковувану) зміну послідовності нуклеотидів ДНК називають мутацією. Мутації можуть відбуватися шляхом заміни однієї пари нуклеотидів іншою (мутації заміщення), або шляхом додавання чи видалення однієї або кількох пар основ (такі мутації називають, відповідно, інсерціями та делеціями). Мутації, що відбуваються у негенних ділянках ДНК, або мають незначний вплив на функції ґена, називають мовчазними мутаціями (які не проявляються фенотипічно – прим. ред.). Лише у рідкісних випадках виникнення мутації надає її носію біологічної переваги, більшість же немовчазних мутацій шкідлива.
У ссавців спостерігається висока кореляція між нагромадженням мутацій і раковими захворюваннями. Брюсом Еймсом розроблено простий тест для визначення здатності хімічної речовини викликати певні мутації у клітинах спеціалізованого штаму бактерій. Ці мутації легко виявити (рисунок 25-19). За допомогою такого тесту встановлено, що деякі хімічні речовини, з якими ми постійно стикаємося у повсякденному житті, мають мутаґенні властивості. Однак понад 90% речовин, канцероґенна природа яких доказана у довготривалих експериментах на тваринах, діяли у тесті Еймса також як мутаґени. Завдяки такій високій кореляції між мутаґенними і канцероґенними властивостями, тест Еймса для бактеріальних мутаґенів широко використовується як швидкий і недорогий спосіб виявлення потенційних для людини канцероґенів.
Упродовж 24-годинного періоду геном типової клітини ссавців нагромаджує багато тисяч ушкоджень, однак завдяки їхній репарації у мутацію перетворюється менше, ніж одне пошкодження із 1000. Хоча молекула ДНК відносно стабільна, але якби не функціонували системи репарації, то сумісний вплив багатьох рідкісних, проте шкідливих реакцій, зробив би процес життя неможливим.
Всі клітини містять численні ситеми репарації ДНК
Кількість і різноманітність репаративних систем свідчить як про важливість процесу репарації ДНК для виживання клітин, так і про існування різноманітних джерел ушкодження ДНК (Таблиця 25-5). Деякі поширені типи ушкоджень, як, наприклад, піримідинові димери (див. Рисунок 8-34) можуть виправляти різні системи. На відміну від метаболічних шляхів, де враховується і оптимально використовується кожна молекула ATP, процеси репарації ДНК часто дуже енерґетично невигідні. Але якщо необхідно забезпечити цілісність ґенетичної інформації, то очевидно, що економія на використанні хімічної енерґії для репарації ДНК себе не виправдовує.
Процес репарації ДНК значною мірою можливий завдяки тому, що її молекула складається з двох ланцюгів. Пошкодження в одному ланцюзі можна видалити і точно виправити, використовуючи як матрицю непошкоджений комплементарний ланцюг. Розглянемо головні типи репаративних систем, починаючи з тих, що виправляють рідкісні помилково спаровані нуклеотиди, які залишаються у молекулі ДНК після завершення реплікації.
Репарація помилок спаровування (тобто некомплементарного спаровування, англ. mismatches). Виправлення помилок спаровування після реплікації у E. сoli підвищує загальну точність реплікації у 102 - 103 раз. Для цього майже завжди використовується інформація, що міститься у матричному ланцюзі, а тому система репарації повинна якимось чином розрізняти матричний і новосинтезований ланцюги ДНК. Досягається це завдяки міченню матричної ДНК метильною групою, що допомагає відрізнити її від новосинтезованого ланцюга. Система репарації некомплементарного спаровування у E. сoli включає щонайменше 12 протеїнових компонентів (Таблиця 25-5), які беруть участь або в розпізнаванні ланцюгів ДНК, або ж у самому процесі репарації.
На відміну від E. coli і деяких близьких до неї бактерій, механізм розпізнавання ланцюга ДНК у більшості бактерій і еукаріотів вивчено ще недостатньо,. У цих прокаріотів розпізнавання ланцюгів ґрунтується на дії Dam-метилази (Таблиця 25-3), яка, як ви пам”ятаєте, метилює ДНК в N6- положенні усіх молекул аденінів, розташованих всередині послідовності (5’)GATC. Зразу ж після проходження реплікативної вилки існує короткий проміжок часу (кілька секунд чи хвилин), упродовж якого метилюється лише матричний ланцюг (Рис.25-20), у той час як послідовності GATC у складі новосинтезованого ланцюга тимчасово перебувають у неметильованому стані. Це забезпечує можливість розрізнення новосинтезованого і матричного ланцюгів. Некоректне спаровування під час реплікації поблизу напівметильованої GATC-послідовності репарується відповідно до інформації, закодованої у метильованому батьківському (матричному) ланцюзі. Тестування in vitro виявило, що у випадку метилювання послідовності GATC в обох ланцюгах репарується небагато помилок; якщо ж обидва ланцюги ДНК не містять метильованих послідовностей, то процес репарації відбувається, але перевага не надається жодному з ланцюгів. Така метил-спрямована репаративна система ефективно виправляє помилки у проміжку до 1000 п.о. від напівметильованої GATC-послідовності. Для багатьох видів бактерій механізм розпізнавання ланцюгів у процесі репарації помилок спаровування все ще не з’ясовано.
Яким же чином відносно віддалені GATC-послідовності регулюють реакції репарації некомплементарного спаровування? Механізм цього процесу зображено на Рис. 25-21. Протеїн MutL утворює комплекс з протеїном MutS, який зв”язується з усіма помилково спарованими основами (за винятком С-С). Протеїн MutH з”єднується з MutL і з послідовністями GATC, на які натрапляє комплекс MutL-MutS. Ділянки ДНК, розташовані з обох боків місця помилкового спаровування, протягуються через комплекс MutL-MutS, внаслідок чого утворюється петля ДНК; одночасне переміщення обох сторін петлі через комплекс рівнозначне руху комплексу водночас в обох напрямках вздовж молекули ДНК. Протеїну MutH властива сайт- специфічна ендонуклеазна активність, яка не проявляється доти, доки комплекс не зустрінеться з напівметильованою послідовністю GATC. У цьому місці MutH каталізує розщеплення неметильованого ланцюга на 5’-стороні основи G у складі GATС-послідовності, що позначає місце репарації. Подальші етапи цього шляху залежать від того, де локалізована помилка по відношенню до місця розщеплення (Рис. 25-22).
У випадку, якщо некомплементарні пари розташовані на 5’-стороні сайту розщеплення, неметильований ланцюг розкручується і деградує у напрямку 3’5’ від місця розщеплення разом із помилково спарованими основами, і цей сеґмент замінюється новою ДНК. Цей процес відбувається завдяки спільній дії ДНК-гелікази II, SSB, екзонуклеаз I або X (обидві деґрадують ланцюги ДНК в напрямку 3’5’), ДНК-полімерази III і ДНК-ліґази. Спосіб репарації помилкового спаровування на 3’-стороні від місця розщеплення подібний, за винятком того, що використовується або екзонуклеаза VII (яка деґрадує одноланцюгову ДНК у будь-якому напрямку), або ж нуклеаза RecJ (яка деградує одноланцюгову ДНК у напрямку 5’3’).
Процес репарації помилок спаровування у клітинах бактерії E. coli пов’язаний із значними витратами енергії, оскільки помилка може розташовуватися на відстані 1000 чи й більше п.о. від GATC-послідовності. Отже, деґрадація і заміщення сеґмента ланцюга такої довжини потребує великої кількості енерґії для того, щоб активовані дезоксинуклеотидні попередники репарували одну неправильно спаровану основу. Це ще раз підкреслює важливе значення для клітини цілісності її ґеному.
Всі еукаріотичні клітини містять протеїни, що структурно і функціонально аналоґічні бактеріальним протеїнам MutS та MutL (але не MutH). Зміни в ґенах людини, які кодують протеїни цього типу, можуть бути причиною деяких дуже поширених спадкових синдромів схильності до ракових захворювань (Додаток 25-1), що також вказує на значення систем репарації ДНК для орґанізму. Головними гомолоґами MutS у більшості еукаріотів (від дріжджів до людини) є MSH2 (MutS homolog 2), MSH3 і MSH6. Гетеродимери MSH2 і MSH6 переважно зв'язуються з поодинокими помилково спарованими основами і, меншою мірою, з дещо довшими помилково спарованими петлями. Натомість у багатьох орґанізмів з довшими помилково спарованими відрізками (від 2 до 6 п.о.) можуть зв'язуватися гетеродимери MSH2 і MSH3, або ж обидва типи цих гетеродимерів разом. Гомолоґи MutL, переважно гетеродимер MLH1 і PMS1 (від англ. post-meiotic segregation, тобто розходження хромосом після мейозу), зв'язують і стабілізують MSH-комплекси. Дослідження деталей і послідовності подій у процесі репарації помилок спаровування у клітинах еукаріотів продовжується і у наш час. Наприклад, ми ще не знаємо механізму ідентифікації новосинтезованих ланцюгів ДНК, проте вже доведено, що цей механізм не включає використання послідовностей GATC.
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
Додаток 25-1 БІОХІМІЯ У МЕДИЦИНІ
Репарація ДНК і ракові захворювання
В організмі людини рак виникає у тих випадках, коли певні ґени, які реґулюють нормальний поділ клітини (онкоґени і ґени-супресори пухлин; див. розділ 12) не функціонують, активуються у невідповідний час або зазнають змін. Унаслідок цього ріст клітин може вийти з-під конторолю, що призводить до утворення пухлин. Ґени, які контролюють поділ клітин, можуть пошкоджуватися внаслідок спонтанних мутацій чи вторгнення пухлинних вірусів (онковірусів, розділ 26). Тому очевидно, що зміни у процесі репарації ДНК, які спричиняють зростання частоти мутацій, можуть суттєво підвищити сприйнятливість орґанізму до раку. Встановлено зв'язок між раковими захворювань у людей та дефектами ґенів, які кодують протеїни, задіяні у репарації шляхом вирізання нуклеотидів, репарації некомплементарного спаровування, рекомбінативній репарації і синтезі через ушкодження з пропуском помилок (англ. error-prone translesion synthesis). Очевидно, що репарація ДНК у цих випадках може виявитися питанням життя або смерті.
Репарація способом вирізання нуклеотидів у клітинах людини потребує більшої кількості протеїнів, ніж у бактерій, хоча загалом ці шляхи дуже подібні. Ґенетичні дефекти, наслідком яких є інактивування процесу репарації шляхом вирізання нуклеотидів, пов’язані з кількома ґенетичними захворюваннями, найкраще вивченим з яких є піґментна ксеродермія, скорочено XP (лат. - xeroderma pigmentosum). Оскільки репарація вирізанням нуклеотидів - єдиний шлях репарації піримідинових димерів у людини, то хворі на ХР надзвичайно чутливі до світла і у них під дією сонячного випромінювання може легко розвинутися рак шкіри. Більшість людей з ХР мають також невролоґічні відхилення, головним чином через те, що у них не відбувається репарація певних ушкоджень, спричинених високим рівнем окисного метаболізму в нейронах. До захворювань на ХР можуть призвести дефекти в ґенах, що кодують один з принаймні семи протеїнових компонентів системи репарації шляхом вирізання нуклеотидів; у зв’язку з цим виділяють сім ґенетичних підтипів захворювання, які позначають від ХРА до XPG. Деякі з цих протеїнів (особливо XPB, XPD і XPG) відіграють також роль у спряженій з транскрипцією репарації оксидативних ушкоджень шляхом вирізанням основ, що описано в розділі 26.
У більшості мікроорґанізмів існують додаткові шляхи для репарації циклобутанових піримідинових димерів, зокрема альтернативою до способу репарації шляхом вирізання нуклеотидів є використання ДНК-фотоліази, а іноді репарація шляхом вирізання основ, однак у людини та інших плацентних ссавців вони не виявлені. Така відсутність альтернативи до способу репарації шляхом вирізання нуклеотидів для видалення піримідинових димерів привела до припущення, що початок еволюції ссавців поклали малі пухнасті нічні тварини, яким не потрібно було репарувати ушкодження, спричинені ультрафіолетовим світлом. Проте ссавцям притаманний механізм оминання циклобутанових піримідинових димерів, котрий включає ДНК-полімеразу η. Цей ензим зменшує до мінімуму виникнення мутацій шляхом інсерції двох залишків А навпроти піримідинового димеру Т-Т. Люди з генетичним дефектом, що призводить до втрати функції ДНК-полімерази η, мають ХР-подібну хворобу, яку назвали ХР-варіант, або XP-V. Клінічні прояви XP-V подібні до класичного захворювання на ХР, хоча рівень мутацій виявляється значно вищим після опромінення клітин ультрафіолетом. Очевидно, в нормальних клітинах людини репаративна система вирізання нуклеотидів функціонує узгоджено з ензимом ДНК-полімеразою η, виправляючи і/або оминаючи піримідинові димери, коли необхідно забезпечити ріст клітин та реплікацію ДНК. Опромінення УФ- світлом викликає появу значної кількості піримідинових димерів; для того, щоб процес реплікації міг продовжуватися, деякі із них потрібно обов’язково обминути шляхом синтезу через ушкодження . За відсутності однієї з систем репарації, її функція частково компенсується іншою системою. Втрата активності полімерази η призводить до зупинки реплікативних вилок і оминання УФ-ушкодженнь за участю інших, більш мутаґенних полімераз, що здійснюють синтез через ушкодження (їх називають TLS-полімеразами, від англ. translession synthesis). У разі відсутності інших систем репарації ДНК, викликане зростання рівня мутацій часто спричиняє ракові захворювання.
Один з найпоширеніших спадкових синдромів схильності до раку - це спадковий неполіпозний рак товстої кишки – СНРТК (англ. - HNPCC, від hereditary nonpolyposis colon cancer). Встановлено, що цей синдром пов’язаний з дефектами в репарації помилок спаровування. Клітини людини та інших еукаріотів містять декілька протеїнів - аналогів бактеріальних протеїнів MutL і MutS (див. Рис. 25-21). До захворювання на СНРТК можуть призвести дефекти принаймні у п”яти різних ґенах , що беруть участь у репарації неправильного спаровування. Найчастіше зустрічаються дефекти в ґенах hMLH1 (від англ. - human MutL homolog 1, тобто людський гомолог І протеїну MutL) та hMSH2. В індивідуумів з СНРТК рак зазвичай розвивається у ранньому віці, і найчастіше це рак товстої кишки.
Більшість захворювань на рак грудей трапляється у жінок без встановленої генетичної схильності. Однак близько 10% випадків пов’язують зі спадковими дефектами двох ґенів - BRCA1 та BRCA2. Продуктами цих генів є великі протеїни BRCA1 та BRCA2 (у людини вони складаються із 1834 та 3418 амінокислотних залишків відповідно). Вони взаємодіють з великим числом інших протеїнів, задіяних у транскрипції, підтримці структури хромосом, репарації ДНК і контролі клітинного циклу. Точні молекулярні функції BRCA1 і BRCA2 ще не встановлено. Ризик захворіти на рак грудей у жінок з дефектами у генах BRCA1 або BРЦА2 зростає більше, ніж на 80%.
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
Репарація шляхом вирізання основ (інша назва – ексцизійна репарація основ). Кожна клітина містить клас ензимів, що носять назву ДНК-ґлікозилази, які розпізнають найпоширеніші ушкодження ДНК (наприклад, продукти дезамінування цитозину і аденіну; див. рис. 8-33а) і видаляють змінені основи шляхом розщеплення N-ґлікозильного зв”язку. Унаслідок цього виникає апуринова чи апіримідинова ділянка у послідовності ДНК, яку називають АП-сайтом, або сайтом, що не містить основи. Окремі ДНК-ґлікозилази здебільшого специфічні до одного типу ушкоджень.
Виявлені у більшості клітин урацил-ДНК-ґлікозилази, наприклад, специфічно видаляють з молекули ДНК урацил, що утворюється внаслідок спонтанного дезамінування цитозину. Мутантні клітини, які не містять цього ензиму, мають високе співвідношення частоти мутацій G≡C до А=Т. У той же час ця ґлікозилаза не видаляє залишки урацилу з РНК чи залишки тиміну з ДНК. Така здатність відрізняти тимін від урацилу - продукту дезамінування цитозину, що є обов”язковим для вибіркової репарації останнього, може бути однією з причин, чому в процесі еволюції до складу ДНК ввійшов тимін, а не урацил (стр. ).
Клітини бактерій переважно містять лише один тип урацил-ДНК-ґлікозилаз, тоді як в організмі людини їх існує принаймні чотири типи з різною специфічністю, що свідчить про важливість реакції видалення урацилу з молекули ДНК. Найпоширеніша з них урацил-ґлікозилаза UNG в організмі людини зв'язана з реплісомою і видаляє залишки U, випадково включені замість Т у ланцюг ДНК під час реплікації. Дезамінування залишків С в одноланцюговій ДНК відбувається у 100 разів швидше, ніж у дволанцюговій, а клітини людини містять ензим hSMUG1, який видаляє всі залишки U, що утворюються в одноланцюговій ДНК під час реплікації чи транскрипції. Дві інші ДНК-ґлікозилази людини, TDG і MBD4, видаляють спаровані з G залишки U чи T, які утворюються у разі дезамінування, відповідно, цитозину чи 5-метилцитозину.
Інші ДНК-ґлікозилази розрізняють та видаляють пошкоджені основи, у тому числі формамідопіримідин і 8-гідроксиґуанін (обидві утворюються внаслідок окиснення пуринів), гіпоксантин (утворюється внаслідок дезамінування аденіну) та алкільовані основи, такі як 3-метиладенін та 7-метилґуанін. У деяких класах орґанізмів виявлено також ґлікозилази, які розпізнають інші ушкодження, включно з піримідиновими димерами. Нагадаємо, що АП-сайт утворюється також внаслідок повільного спонтанного гідролізу N-ґлікозильних зв”язків в ДНК (див. Рис. 8-33б).
Після формування АП-сайту інша група ензимів повинна відразу ж його репарувати, проте цей процес відбувається не шляхом простої інсерції нової основи і утворення нового N-ґлікозильного зв”язку. Натомість спочатку видаляється і заміщується новим нуклеотидом дезоксирибозо-5’-фосфат. Розпочинають цей процес ензими АП-ендонуклеази, які розрізають ланцюг ДНК, що містить АП-сайт. Положення розрізу відносно АП-сайту (з 5’- чи 3’- сторони) залежить від типу АП-ендонуклеази. Далі сеґмент ДНК, що містить АП-сайт, видаляється, на його місці ДНК-полімераза I синтезує новий сеґмент ДНК, а ДНК-ліґаза зшиває розрив (Рис. 25-23). У клітинах еукаріотів заміщення нуклеотидів здійснюють описані нижче спеціалізовані полімерази.
Репарація шляхом вирізання нуклеотидів (інша назва – ексцизійна репарація нуклеотидів). Ушкодження, які спричиняють великі деформації у спіральній структурі ДНК, як правило, репарує система вирізання нуклеотидів; цей шлях репарації має критичне значення для виживання всіх вільноживучих організмів. У випадку репарації шляхом вирізанням нуклеотидів (Рис.25-24) мультисубодиничний ензим гідролізує два фосфодіефірні зв”язки з обох сторін спричиненої ушкодженням структурної деформації. В E. сoli та інших прокаріотів ця ензимна система гідролізує п”ятий фосфодіефірний зв”язок на 3’-стороні і восьмий фосфодіефірний зв”язок на 5’- стороні з утворенням фраґменту завдовжки від 12 до13 нуклеотидів (залежно від того, включає пошкодження одну чи дві основи). У людини та інших еукаріотів ензимна система гідролізує шостий фосфодіефірний зв”язок на 3’-стороні та двадцять другий - на 5’-стороні, внаслідок чого утворюється фраґмент завдовжки 27-29 нуклеотидів. Після такого подвійного розрізання вирізані олігонуклеотиди видаляються із дуплекса, а утворений проміжок заповнюється ДНК-полімеразою I - у клітинах E. сoli, чи ДНК-полімеразою - у клітинах людини. Розрив ланцюга зшивається ДНК-ліґазою.
Головним ензиматичним комплексом у клітинах E. сoli є ABC-ексцинуклеаза, яка складається із трьох субодиниць: UvrA (Мr 104 000), UvrB (Мr 78 000) та UvrC (Мr 68 000). Термін "ексцинуклеаза" (тобто ексцизійна нуклеаза, від англ. excise – вирізати) вживають для підкреслення унікальної здатності цього комплексу каталізувати два специфічні ендонуклеолітичні розщеплення, що відрізняє його від звичайних ендонуклеаз. Комплекс протеїнів UvrA та UvrB (А2В) сканує ( «оглядає») ДНК і зв”язується з ушкодженою ділянкою. Димер UvrA дисоціює від міцно з’єднаного комплексу UvrB-ДНК, а до UvrB приєднується протеїн UvrC; далі протеїн UvrB розрізає ланцюг у місці п”ятого фосфодіефірного зв”язку на 3’-стороні ушкодження, а протеїн UvrС – у місці восьмого фосфодіефірного зв”язку на 5’-стороні. Утворений фрагмент із 12-13 нуклеотидів видаляє UvrD-геліказа. Невеликий проміжок заповнює ДНК-полімераза I і зшиває ДНК-ліґаза. Описаний шлях відіграє головну роль у репарації багатьох типів ушкоджень, у тому числі циклобутанових піримідинових димерів, 6-4 фотопродуктів (див. рис. 8-34) та декількох інших типів адуктів основ (модифікованих основ), включно із бензо[a]пірен-ґуаніном, що утворюється у молекулі ДНК під дією сигаретного диму. Особливість нуклеолітичної активності ABC-ексцинуклеази полягає у тому, що вона робить два розрізи у ланцюзі ДНК (Рис.25-24).
Механізм функціонування еукаріотичних ексцинуклеаз дуже подібний до бактеріальних, хоча ті 16 поліпептидів, що необхідні для подвійного розрізання ланцюга ДНК, не подібні до субодиниць ексцинуклеази E. сoli. Як буде описано у розділі 26, іноді процеси репарації шляхом вирізання нуклеотидів та основ у еукаріотів пов'язані з транскрипцією. У людини наявність генетичних дефектів у системі репарації шляхом вирізання нуклеотидів спричиняє різноманітні серйозні захворювання (додаток 25-1).
Пряма репарація. Репарація деяких типів ушкоджень відбувається без видалення основи чи нуклеотиду. Найкраще дослідженим прикладом такого шляху є пряма фотореактивація циклобутанових піримідинових димерів у реакції, яку каталізують ензими ДНК-фотоліази. Піримідинові димери утворюються внаслідок дії ультрафіолетового випромінювання, а фотоліази використовують енерґію поглиненого світла для репарації ушкодження (Рис.25-25). Як правило, фотоліази містять два кофактори, що є поглиначами світла, або хромофорами. Одним з хромофорів завжди слугує FADH , а функцію іншого хромофору в E. сoli і дріжджів виконує фолат. Механізм реакції пов’язаний з утворенням вільних радикалів. У клітинах плацентарних ссавців (у тому числі і у людини) ДНК-фотоліази не виявлені.
Іншим прикладом прямої репарації є репарація нуклеотидів, пошкоджених внаслідок алкілювання. Поширеним і високомутагенним ушкодженням є наявність модифікованого нуклеотиду О6–метилґуаніну, що утворюється під дією алкілювальних агентів (стр. ). Під час реплікації він формує пари не з цитозином, а з тиміном, і тому викликає мутації G≡C на А=Т (Рис.25-26). Пряму репарацію О6–метилґуаніну здійснює протеїн О6–метилґуанін-ДНК-метилтрансфераза, який каталізує перенесення метильної групи О6–метилґуаніну на один зі своїх цистеїнових залишків. Строго кажучи, ця метилтрансфераза не є ензимом, тому що єдина реакція перенесення метилу незворотно метилює протеїн, внаслідок чого він стає неактивним у цьому метаболічному шляху. Використання цілої молекули протеїну для корекції однієї пошкодженої основи – це ще один яскравий приклад важливості підтримання цілісності клітинної ДНК.
Дуже відмінний, але також прямий механізм використовується для репарації 1-метиладеніну і 3-метилцитозину. Аміногрупи залишків А і С іноді метилюються, перебуваючи у складі одноланцюгової молекули ДНК, що безпосередньо впливає на спаровування основ. Окисне деметилювання цих алкільованих нуклеотидів в E. coli опосередковується протеїном AlkB, представником надродини α-кетоґлютарат-Fe2+-залежних діоксиґеназ (Рис. 25-27). (Див. додаток 4-3, що містить опис іншого протеїну з цієї родини ензимів).
Взаємодія реплікативних вилок з ушкодженою ДНК може призводити до синтезу ДНК через ушкодження з пропуском помилок
Розглянуті вище шляхи репарації стосувалися головним чином ушкоджень, які виникають у подвійноланцюговій молекулі ДНК; у цих випадках повне відновлення ушкодженого ланцюга забезпечує ґенетична інформація, що міститься в інтактному ланцюзі ДНК. Однак за певних типів ушкоджень, наприклад, при розриві подвійного ланцюга, утворенні поперечних зв”язків між ланцюгами, чи ушкодженні в одноланцюговій молекулі ДНК, комплементарний ланцюг або також пошкоджений, або взагалі відсутній. Розриви подвійного ланцюга та ушкодження одноланцюгової ДНК найчастіше трапляються тоді, коли реплікативна вилка зустрічається із невиправленими ушкодженнями в ДНК (Рис. 25-28). Такі типи ушкоджень, як і поперечні зв”язки між ланцюгами, можуть утворюватися внаслідок дії іонізуючої радіації та окисних реакцій.
У випадку гальмування реплікативної вилки у бактерій існує два шляхи для подальшого налагодження її роботи. За відсутності другого ланцюга для точної репарації використовується інформація, закодована в іншій, гомолоґічній хромосомі, отже, у цьому випадку відбувається гомолоґічна ґенетична рекомбінація. Цей процес отримав назву рекомбінативна репарація ДНК і детально розглянутий далі у підрозділі 25.3. За інших умов включається шлях репарації, що має назву синтез ДНК через ушкодження з пропуском помилок (англ. error-prone translesion DNA synthesis, часто скорочують як TLS; у цьому значенні вживають і терміни «потенційно некоректний синтез ДНК з оминанням пошкоджень», «неточний синтез», «схильна до помилок репарація» і т.п. – прим. ред.). У разі активування цієї системи процес репарації ДНК відбувається з меншою точністю, внаслідок чого може виникнути значна кількість мутацій. У бактерій синтез ДНК через ушкодження з пропуском помилок є частиною стресової відповіді клітини на значне пошкодження ДНК, відомої під досить доречною назвою “SOS-відповідь”. Функцію деяких SOS-протеїнів, наприклад, UvrA і UvrB, уже з’ясовано (Табл.25-6). Вони наявні у клітині за нормальних умов, але у випадку SOS–відповіді рівень їх значно зростає. У шляху репаративного синтезу ДНК через ушкодження з пропуском помилок задіяні додаткові SOS-протеїни, це, зокрема, протеїни UmuC і UmuD ( скорочення “Umu” походить від англ. unmutable, тобто немутабільний; у разі втрати функції гена umu, цей шлях репарації не відбувається). У процесі індукції SOS–відповіді протеїн UmuD розщеплюється до коротшої форми UmuD’, яка формує комплекс із протеїном UmuC; такий комплекс виконує функцію спеціалізованої ДНК-полімерази (ДНК-полімерази V), здатної реплікувати багато ушкоджень ДНК, які в нормі блокують реплікацію. У ділянці такого ушкодженя правильне спаровування основ часто неможливе, тому цей шлях реплікації через ушкодження має схильність до помилок.
Існування репаративної системи, що фактично підвищує рівень мутацій, може здатися несумісним з положенням про важливість ґенетичної цілісності, на якому ми наголошуємо впродовж цього розділу. Однак таку систему слід розглядати з точки зору стратеґії “відчаю”. Експресія генів umuC і umuD повністю індукується лише на кінцевих стадіях SOS-відповіді, і вони не активуються для ініційованого розщепленням UmuD синтезу через ушкодження доти, доки рівень ушкоджень ДНК не стане особливо високим і функція всіх реплікативних вилок заблокується. Мутації, що виникають внаслідок опосередкованої ДНК-полімеразою V реплікації, призводять до загибелі деяких клітин і спричиняють шкідливі мутації в інших клітинах, але це є біологічна ціна, яку змушений платити організм за подолання того бар’єру для процесу реплікації, який іншим шляхом подолати неможливо. Врешті, це забезпечує виживання хоча б кількох мутантних клітин.
Окрім ДНК-полімерази V, для реплікації через пошкодження необхідні протеїн RecA, SSB та окремі субодиниці, що походять від ДНК-полімерази III. Під час SOS-відповіді індукується також синтез іншої ДНК-полімерази, а саме ДНК-полімерази IV. Реплікація за участю ДНК-полімерази IV, яка є продуктом ґену dinB, також супроводжується багатьма помилками. Бактеріальні ДНК-полімерази IV і V входять до родини TLS-полімераз, виявлених в усіх орґанізмах. Цим ензимам не властива коригувальна екзонуклеазна активність, а тому точність відбору основ у процесі реплікації може зменшуватися на два порядки, а загальна точність реплікації - до однієї помилки на ~1 000 нуклеотидів.
У ссавців також виявлено численні ДНК-полімерази з родини TLS-полімераз, для яких характерна низька точність реплікації. Однак наявність цих ензимів не обов'язково зумовлює неприйнятну кількість мутацій, оскільки більшість з них виконують і спеціалізовані функції у процесі репарації ДНК. Наприклад, ДНК-полімераза η (ета) – це TLS-полімераза, що міститься в усіх еукаріотів. Вона забезпечує синтез за наявності ушкоджень, головним чином. у вигляді циклобутанових димерів Т-Т. Рівень мутацій у цьому випадку незначний, оскільки ензим переважно вводить два залишки А навпроти зв'язаних залишків Т. Кілька інших полімераз, для яких характерна низька точність синтезу, у тому числі полімерази β, ι (іота) і λ, в еукаріотичних клітинах виконують спеціалізовані функції у процесі репарації шляхом вирізання основ. Кожному із цих ензимів, окрім полімеразної активності, властива активність 5'-дезоксирибозофосфатліази. Після видалення основи ґлікозилазою і розщеплення ланцюга АП-ендонуклеазою, ці ензими видаляють АП-сайт (5'-дезоскирибозофосфат) і завдяки своїй полімеразній активності заповнюють цю досить невелику прогалину. Частота мутацій, яку може зумовити активність ДНК-полімерази η, незначна, що пов’язано із синтезом дуже короткої ДНК (часто це всього один нуклеотид).
Вивчення процесів репарації ДНК дозволило з’ясувати загальну картину метаболізму ДНК, який забезпечує ґенетичну цілісність за допомогою численних, часто надлишкових (резервних) систем. У ґеномі людини понад 130 ґенів кодують протеїни, задіяні у репарації ДНК. У багатьох випадках втрата функції одного з цих протеїнів призводить до нестабільності ґеному і зростання ризику онкоґенезу (додаток 25-1). Ці системи репарації часто поєднуються з системами реплікації ДНК і доповнюються системами рекомбінації, які ми розглянемо у наступному підрозділі.
Підсумок 25.2. РепараціяДНК
■У клітинах існує багато систем репарації ДНК. Репарація помилок спаровування в E. coli регулюється шляхом тимчасової затримки метилювання послідовностей (5')GATC у складі новосинтезованого ланцюга.
■Системи репарації шляхом вирізання основ розпізнають і виправляють ушкодження, спричинені впливом зовнішніх чинників (таких як радіація і алкілювальні аґенти) і спонтанними змінами окремих нуклеотидів. Деякі системи репарації розпізнають і вирізають лише пошкоджені чи неправильні основи, внаслідок чого у складі ДНК залишаються АП- сайти, що не містять основи. У подальшому вони репаруються шляхом вирізання і заміни цієї ділянки сеґментом ДНК, який містить АП-сайт.
■Системи репарації шляхом вирізання нуклеотидів розпізнають і видаляють різноманітні великі ушкодження та піримідинові димери. Вони вирізають сеґмент ланцюга ДНК, що містить ушкодження, а утворений проміжок заповнюється за рахунок активності ДНК-полімерази і ДНК-ліґази.
■ Деякі ушкодження ДНК репаруються прямо шляхом зворотної реакції до тієї, яка викликала пошкодження; наприклад, піримідинові димери безпосередньо перетворюються на мономерні піримідини за участю фотоліаз, а метильна група О6-метилґуаніну видаляється метилтрансферазою.
■У клітинах бактерій у відповідь на дуже значне ушкодження ДНК спостерігається синтез ДНК через ушкодження з пропуском помилок, який здійснюють TLS-ДНК-полімерази. В еукаріотів подібні полімерази виконують специфічні функції у репарації ДНК, що зводить до мінімуму можливість виникнення мутацій.