4.5. Стабилизация ферментов путем иммобилизации

В живых системах ферменты способны длительно работать без потери активности. В искусственных условиях ферментные пре­параты после одноразового использования обычно инактивируются, при этом обрабатываемый материал загрязняется препаратом. Поэтому были созданы новые формы ферментных препаратов многократного использования. Наибольшее распространение по­лучили препараты, в которых ферменты в активной форме при­креплены к нерастворимой основе. Такие ферментные препара­ты называются в литературе по-разному: связанные, пришитые, фиксированные, матрицированные, прикрепленные, но чаще все­го их называют иммобилизованными. Иммобилизованный ферментный препарат — это единая система, которая со­стоит из трех частей: фермента, носителя и связующего их звена.

Для иммобилизации ферментов большое значение имеют при­рода функциональных групп белка; характер реакций, которые они катализируют; положение активного центра; наличие или от­сутствие простетической группы, небелкового фрагмента и т.д. Некоторые группы белка особенно легко подвергаются химическим превращениям. Например, остатки тирозина легко атакуются электрофильными реагентами и вступают в реакции азосочетания, галоидирования, нитрования и др.; остатки метионина и дисульфидные группы легко подвергаются окислительно-восстано­вительным превращениям.

Условно реакции модификации функциональных групп белка можно разделить на реакции замещения, присоединения и отщеп­ления. Для иммобилизации ферментов имеют значение реакции присоединения по карбоксильным группам реагента или белка, реакции замещения; по типу превращений можно различать реак­ции ацилирования, алкилирования, конденсации, окисления-вос­становления, азосочетания и т. д.

Все носители подразделяют на две группы: органические поли­мерные и неорганические носители.

Носитель имеет очень большое значение для успешной иммо­билизации ферментов. К носителям предъявляются определенные требования: нерастворимость в реакционной среде; иной заряд, чем у фермента; высокая гидрофильность; химическая, биологи­ческая стойкость; механическая прочность; отсутствие способно­сти к неспецифической адсорбции и сильным конформационным изменениям молекулы белка; способность гранулироваться и ак­тивироваться. Носители для иммобилизации могут иметь зернис­тую структуру, могут быть выполнены в виде волокон, пленок, полых трубок, мембран.

Органические полимерные носители. Они разделяются на при­родные и синтетические. Природные носители бывают полисахаридные и белковые. Синтетические полимерные носители подраз­деляются на полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные.

Основой природных полисахаридных носителей могут быть целлюлоза, декстран, агароза, губчатый крахмал, хитин и другие полисахариды.

В качестве носителей ферментов можно использовать белки. Но они подвержены микробному воздействию и вызывают им­мунную реакцию. Исключением является только коллаген, обра­ботанный танином. В качестве белковых носителей применяют коллаген, его модифицированные формы, желатин, кератин, не­растворимые глобулины хлопчатника и некоторые другие белки.

Синтетические полимерные носители используют для иммо­билизации ферментов методами адсорбции, включения в гель, ковалентного связывания и микрокапсулирования. Для процессов адсорбции их применяют в виде макро- и микропористых матери­алов. Чаще всего используют ионообменники типа дауэкса и амберлита, представляющие собой сополимеры стирола и дивинилбензола в форме гранул. Для иммобилизации ферментов в гель чаще используют носители на основе полиакриламида, гели поливинилового спирта и других полимеров (сополимеры этилгликольметакрилата, диметакрилата и т. д.) — реже.

Существует очень много синтетических полимерных носителей.

Неорганические носители. В эту группу носителей входят: син­тетические кремнеземные сорбенты, металлы и их оксиды, нержа­веющая сталь, различные виды глин, керамики и природные ми­нералы. Неорганические носители обладают рядом неоспоримых достоинств. Они легко регенерируются, им можно придать любой вид (порошки, шарики, частицы неправильной формы, пористый материал или монолит, образующий многоканальную систему).

Сшивающие агенты. Для иммобилизации используют очень ши­рокий круг различных агентов, пригодных для активации поли­мерных носителей, непосредственной конденсации белков на но­сителях, содержащих различные функциональные группы.

Наиболее широко для иммобилизации ферментов используют следующие сшивающие соединения: глутаровый альдегид, изоксалевые соли, галогенцианы (чаще бромциан), 1,6-гексаметилендиамин, изоцианиды, карбодиимиды, карбонилдиимидазол, n-нитробензоилхлорид, ненасыщенные сульфоны.

Способы иммобилизации ферментов. Их можно подразделить на две большие группы: химические и физические, т. е. с образовани­ем ковалентных связей и без их участия.

Физические методы заключаются в связывании фермен­та без участия ковалентных связей. Они подразделяются на два типа: адсорбционные и механические. При адсорбционной иммоби­лизации фермент удерживается на поверхности носителя с помо­щью электростатических, гидрофобных, водородных связей, а также в силу дисперсионных взаимодействий. При механической иммобилизации производят включение фермента в гели, сшитые поперечными связями, заключение фермента в микрокапсулы, волокна, мембраны и т. д. Все физические методы иммобилиза­ции достаточно просты, быстры и эффективны.

К химическим методам иммобилизации относят иммо­билизацию ферментов путем ковалентного сшивания с полимер­ным носителем и поперечного сшивания ковалентными связями молекул белка без носителя (используется редко). Химический способ является основным способом получения иммобилизован­ных ферментных препаратов. К преимуществам таких препаратов относятся: их стабильность, невымываемость ферментов, умень­шение отрицательного влияния матрицы. Существенный недоста­ток этого способа — значительная инактивация фермента, что случается достаточно часто.

Один из перспективных путей создания высокоактивных поли­ферментных систем — иммобилизация клеток микроорганизмов, но пока он развивается медленно.

Иммобилизованные ферменты по своим свойствам отличаются от нативных, поскольку в результате иммобилизации в той или иной степени изменяется пространственная структура белковой молекулы.

Активность иммобилизованных ферментов в пересчете на 1 мг белка в подавляющем большинстве случаев падает за счет диффу­зионного сопротивления, экранирования активного центра, конформационных изменений молекулы и т.д. Иммобилизованные ферменты проявляют большее сродство к низкомолекулярным суб­стратам. В то же время иммобилизация часто способствует повыше­нию стабильности фермента в более широкой зоне рН и температу­ры, устойчивости к действию ингибиторов, что очень важно при длительном использовании ферментов. Оптимальные рН и темпе­ратура иммобилизованных ферментов почти не меняются, энергия активации ферментативных реакций также остается неизменной.