Радиоиммунный метод (рим)
Сущность метода: метод позволяет в любом биологическом субстрате (моче, крови и т.д.) определять ничтожно малые концентрации растворимых антигенов, продукты метаболизма микроорганизмов, гормоны и пр. на основе конкуренции с радиоактивным антигеном.
Этапы постановки реакции
1. Стандартное количество антигена, идентичного меченому радиоактивной меткой (например, I123, I131, либо другими изотопами) антигену, наливают в пробирку.
2. Добавляют стандартное количество иммунной сыворотки, специфичной антигену. 70- 80% меченного антигена связывается при этом с антителами, образуя радиоактивный преципитат.
3. Добавляют субстрат, исследуемый на присутствие предполагаемого антигена. Если в субстрате есть антиген, идентичный меченному, то он конкурирует с ним, отнимая антитела. Радиоактивность преципитат при этом снижается.
Чем больше в субстрате антигена, тем меньше радиоактивность преципитата.
Приложение 12
Схема постановки основного опыта РСК
Ингредиенты |
Опыт |
Контроль сыворотки |
Контроль антигена на антикомпле-ментарность |
Контроль антигена на гемотоксичность |
1. Диагностическая система |
||||
Сыворотка крови больного, инактивированная при +56 C° 30 мин., мл |
0,5 |
0,5 |
- |
- |
Антиген в рабочей дозе, мл |
0,5 |
- |
0,5 |
0,5 |
Комплемент в рабочей дозе, мл |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
- |
Физ. раствор 0,85 % |
- |
0,5 |
0,5 |
1,0 |
Инкубировать в термостате при 37 C° 60 мин. |
||||
2. Индикаторная система (гемолитическая) |
||||
Гемолитическая сыворотка в рабочей дозе, мл |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
Эритроциты барана 3 % взвесь, мл |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
Инкубировать в термостате при 37С° 60 мин. |
||||
Соединить I и II системы Выдержать при +37С° 60 мин. |
||||
Результаты РСК (пример) |
+ + + + |
- |
- |
- |
Результат гемолиза |
- |
+ |
+ |
- |
Оценку РСК проводят по четырехплюсовой системе:
+ + + + Полная задержка гемолиза, эритроциты в осадке, надосадочная жидкость прозрачная; резко положительная РСК.
+ + + Неполная задержка гемолиза, эритроциты в осадке, надосадочная жидкость прозрачная, слабо розового цвета; положительная РСК.
+ + Частичная задержка гемолиза, осадок эритроцитов незначительный, надосадочная жидкость красно-розового цвета, прозрачная; слабо положительная РСК.
+ Осадок незначительный, жидкость красная; сомнительная РСК.
- Полный гемолиз, прозрачная красная жидкость. Отрицательная РСК.
Приложение 13
СХЕМА ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (В ПРИСУТСТВИИ АНТИГЕНА)
Ингредиенты |
Пробирки |
Контроли антигена |
||||||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
Гемотокс. |
Антикомпл |
|
Комплемент 1:10 |
0,05 |
0,1 |
0,12 |
0,15 |
0,18 |
0,25 |
- |
0,25 |
Физ.раствор, мл |
0,45 |
0,4 |
0,38 |
0,35 |
0,32 |
0,25 |
0,5 |
0,25 |
Антиген, мл |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин. |
||||||||
Гемолитическая система, мл |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин. |
||||||||
Учет результатов |
Задержка гемолиза |
Гемолиз |
Задержка гемолиза |
Гемолиз |
||||
Титр комплемента 0,12 (минимальное количество, дающее гемолиз в гемосистеме).
Рабочая доза 0,15 (чуть больше титра, для гарантии).
Приложение 14
СХЕМА ТИТРОВАНИЯ АНТИГЕНА НА АНТИКОМПЛЕМЕНТАРНОЕ
ДЕЙСТВИЕ
Ингредиенты |
Пробирки |
Контроль антигена на гемотоксичность |
||||||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
||
Антиген, мл |
0,05 |
0,1 |
0,15 |
0,18 |
0,20 |
0,23 |
0,25 |
0,25 |
Физ.раствор 0,85 %, мл |
0,45 |
0,4 |
0,35 |
0,32 |
0,30 |
0,27 |
0,25 |
0,5 |
Комплемент 1: 10, мл |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
- |
Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин. |
||||||||
Гемолитическая система, мл |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин. |
||||||||
Учёт результатов |
Гемолиз |
Задержка гемолиза |
Задержка гемолиза |
|||||
Титр антигена — то минимальное количество АГ, которое не мешает гемолизу. Это 0,18 мл. Рабочая доза должна быть в 2 раза меньше, это – 0,09 мл.
Приложение 15
СХЕМА ТЕТРИРОВАНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ
Ингредиенты |
Пробирки |
||||||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
Физ. раствор 0,85 %, мл |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
Гемолитическая сыворотка 1:50, мл |
0 |
0 ,25 |
0 ,25 |
0 ,25 |
0 ,25 |
0 |
В дез.р. |
Разведение сыворотки
|
1:100 |
1:200 |
1:400 |
1:800 |
1:1600 |
1:3200 |
1:6400 |
Эритроциты барана 3 % взвесь, мл |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин. |
|||||||
С׀ 1:10 в раб. титре |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин. |
|||||||
Учёт результатов |
Гемолиз |
Задержка гемолиза |
|||||
,25
,25
Титр гемолитической сыворотки — то максимальное разведение, которое даёт гемолиз. Это 1: 1600. Рабочий титр должен быть концентрированнее титра в 3-4 раза, т.е. рабочий титр - 1: 400.
Приложение 16