Периодические методы

Изучение процесса биосинтеза начинается с исследования динамики роста периодической культуры.

Засев среды в таком количестве, которое обеспечивает начало роста микроорганизма с минимальной задержкой или даже без лаг-фазы /2% от среды/.

Наблюдение за ходом накопления биомассы и интересующего продукта и за потреблением углеродного сырья. Для этого отбирают пробы.

Наблюдение заканчивают после остановки роста.

Полученные кривые роста и накопления продукта показывают, является ли его образование связанным с ростом биомассы, т.е. первичным, или это процесс второй фазы, когда рост заторможен, но выросшая биомасса может перерабатывать оставшийся недоиспользованным субстрат. Типичными продуктами конструктивного метаболизма второй фазы роста культур являются антибиотики.

Вторичными могут быть и продукты энергетического метаболизма, например, при брожении: первичный метаболизм образует органические кислоты, вторичный - спирты, т.е. целевой продукт. Такая двухфазность брожения была открыта Шапошниковым и затем распространена на другие процессы биосинтеза.

Во вторую фазу могут осуществляться и сверхсинтезы продуктов первой фазы, особенно у специально полученных мутантов, это, например, синтез витаминов.

Биохимические механизмы изменения метаболизма обусловлены репрессией и депрессией синтеза определенных ферментов или изменением их активности. До недавнего времени лимитирующие факторы выявлялись только эмпирическим путем. Целенаправленные поиски факторов, необходимых для каждого процесса, лимитирующего или ингибирующего рост продуцентов, значительно сокращает подбор оптимальных условий для их биосинтеза.

Большинство промышленных биотехнологических процессов ведут на сложных средах, часто используя отходы из-за их дешевизны. Поэтому в лабораторных условиях процесс отрабатывается на тех же средах: определяют фазу наиболее активного биосинтеза целевого продукта, его скорость, продуктивность, оптимальную рН, степень аэрации.

Для оптимизации роста микроорганизмов этого достаточно. На сложных средах невозможно выявить лимитирующие рост культур компоненты: источники углерода, N, Р, витамины, недостаток которых приводит к синтезу вторичных метаболитов. Этот вопрос можно решить только на синтетических или полусинтетических средах. Применяя набор синтетических сред с заранее предусмотренным ограничением роста культур микроорганизмов известным компонентом, выявляют нужный для данного синтеза лимитирующий или ингибирующий фактор и нужные концентрации других компонентов, чтобы они не были в недостатке.

Применение методов математического планирования эксперимента ускоряет поиск оптимальных

Непрерывное культивирование

Этот метод взят из химической технологии. Принцип проточного культивирования состоит в том, что в сосуд, где размножаются микроорганизмы, непрерывно подается свежая питательная среда и одновременно вытекает такой же объем культуры. Существует две разновидности: процесс полного вытеснения и процесс полного смещения.

Преимущества непрерывных процессов: возможность специализации аппаратуры для каждой операции, стабилизации процесса во времени, улучшения качества продукта, легкость регулировки и автоматизации.

Процесс полного вытеснения

Используют трубчатый ферментер, расположенный горизонтально или вертикально, в который втекают среда и посевной материал, а вытекает культура. Так можно культивировать микроорганизмы, не требующие аэрации. По ходу трубки культура "стареет", субстрат исчерпывается, накапливаются продукты метаболизма, и вытекающая культура находится в состоянии, аналогичном стационарной фазе роста периодической культуры.

Таким образом, в ферментере воспроизводится полная кривая роста, но не во времени, а в пространстве.

В настоящее время разработаны ферментеры, работающие в режиме полного вытеснения при аэробном культивировании, т.е. с аэрацией. Это вращающиеся трубчатые реакторы с насадкой или внутренними аэрирующими элементами, а также многосекционные колонные аппараты. Кривая роста периодической культуры распределяется по ходу аппаратов. Процесс полного вытеснения применяют в тех случаях, когда желательно избежать потери времени на опорожнение, стерилизацию и заполнение емкость. Его применяют в пищевой промышленности, когда используют сложные среды и стоит задача наиболее экономично провести процесс. Пример практического применения трубчатого ферментера - анаэробная стадия при производстве пива в башенных проточных емкостях.

Процесс полного смешения

При этом рост культур идет в ферментере при интенсивном перемешивании мешалкой или продуванием воздуха. По всей массе культуры условия должны быть совершенно одинаковыми. В ферментере создаются условия, соответствующие одной точке кривой роста культуры: при больших скоростях эти условия близки к быстрому экспоненциальному росту, при малых - к условиям стационарной фазы. В установившемся режиме скорость потока среды, отнесенная к единице объема культуры в ферментере, называется коэффициентом разбавления D:

. Он в стационарных условиях равен удельной скорости роста . При этом культура находится в динамическом равновесии ( ) и обладает способностью самопроизвольно автоматически подстраиваться к измененным условиям. На изменение скорости потока культура реагирует соответствующим изменением концентрации биомассы и остаточной концентрацией субстрата, ограничивающей рост, не выходя из стационарного состояния. Но нельзя получить устойчивое состояние только при максимальной скорости роста. Повышение скорости потока приведет к тому, что и культура вымоется из ферментера. Ограничивающим фактором часто является интенсивность аэрации. Из-за слабой растворимости молекулярного кислорода следует применять лишь такую концентрацию субстрата, которая может быть использована при доступной для данной аппаратуры степени аэрирования. При высоких концентрациях субстрата применяют батарею ферментеров, в каждом из которых успевает использоваться только часть субстрата. Хорошо отработанный периодический процесс экономически выгодно воспроизводить в проточном варианте, т.к. культура находится в состоянии максимальной активности, не тратится время на освобождение, заполнения емкостей и на лаг-фазу.

Хемостатное культивирование

Это вариант гомогенного проточного культивирования с заданным желаемым коэффициентом разбавления D, к которому подстраивается скорость роста культуры . При этом задается также фактор, обуславливающий ограничение концентрации вырастающей биомассы, определяемой одним каким-то компонентом питания. При низком μ голодание /т.е. лимитация / будет сильным, при высоком - слабым. Этот метод культивирования широко применяется в лабораторных исследованиях, а в промышленности - тогда, когда известно, какой именно фактор ограничивает рост.

Скорость роста

Баланс лимитирующего рост субстрата:

Изменение количества = приток - унос - потребление субстрата микроорганизмом

Скорость потребления субстрата равна:

,

где - экономический коэффициент или доля потребленного субстрата, пошедшая на синтез биомассы,

Sr -концентрация субстрата в поступающей среде,

S-концентрация субстрата в ферментере.

В стационарном состоянии в ферментере:

,

где - max -возможная скорость роста, Ks -const моно /const насыщения/ равна той остаточной концентрации лимитирующего субстрата, которая ограничивая рост, замедляет его вдвое.

D = -критическая скорость разбавления, теоретически при которой биомассы вымываются из ферментера.

практически

Производительность ферментера по выходу биомассы: R = D_x

Зная основные константы Ks, и Y, можно рассчитать параметры культуры Х и S для любого значения .Хемостатный метод имеет много вариантов. Одностадийное - при необходимости воспроизвести любую скорость роста культур, кроме max. Двухстадийное - в двух последовательных ферментерах позволяет наблюдать культуры при max скорости роста и создать условия для ее превышения. Для этого в первом ферментере ведется культивирование при D < , а во второй подается культура из первого и добавляется свежая среда. Во втором ферментере происходит повышение скорости протока вплоть до превышения, а вымывания не происходит, т.к. из первого ферментера непрерывно поступает культура.