Приходько н. А., Надирова ж.К., Есимова а. М. Лабораторный практикум по дисциплине «Основы биотехнологического производства»

(Для студентов специальности 050701 «Биотехнология»)

Шымкент, 2007

.

Ф.4.7 -008-03

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

ЮЖНО-КАЗАХСТАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. АУЕЗОВА

Кафедра биотехнологии

Приходько н. А., Надирова ж.К., Есимова а. М. Лабораторный практикум по дисциплине «Основы биотехнологического производства»

(Для студентов специальности 050701 «Биотехнология»)

Форма обучения:

дневная и заочная,

кредитная

Шымкент, 2007

ББК 30. 16я 73

Е30

УДК 631. 147(075.8)

Составили: Приходько Н. А., Надирова Ж.К., Есимова А. М.

Лабораторный практикум по дисциплине «Основы биотехнологического производства»: Методические указания для студентов специальностей 050701 «Биотехнология» – Шымкент: ЮКГУ им. М. Ауезова,- 2007.- 63 с.

Рис.2 , табл.2 , список литературы 14 наим.

Методические указания предназначены для студентов III курса дневной и заочной формы обучения по специальности 050701 «Биотехнология» и содержат описание 10 лабораторных работ, охватывающих программу курса в соответствии с Государственным общеобязательным стандартом образования Республики Казахстан.

Рецензент: Нарымбаева З.К.-канд. хим. наук.,и..о. доцента ,кафедра биотехнологии

Рассмотрено и рекомендовано к печати заседанием кафедры БТ(протокол № 1 от «31» 08.06 г)., методическим Советом института(протокол № 1 от «31» 08.06 г.)

Рекомендовано к изданию Научно - Методическим советом ЮКГУ им. М. Ауезова (протокол № от 2007 ).

© Южно-Казахстанский Государственный университет им. М. Ауезова, 2007

Ответственный за выпуск Рысбаева Г.С.

СОДЕРЖАНИЕ

Предисловие 6

Модуль 1.БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОБЪЕКТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВАХ. СЫРЬЕВАЯ БАЗА

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА 7

1. Микроорганизмы - основа биотехнологических производств. Метаболические

возможности микробных клеток. Многообразие процессов катаболизма

и анаболизма. 7

2. Сырьевая база биотехнологического производства. Приготовление

и стерилизация питательных сред. 16

3. Контроль стерильности питательной среды и воздуха 20

4. Характеристика микроорганизмов, осуществляющих спиртовое

и молочнокислое брожение. 26

5. Подготовка, характеристики посевного материала в зависимости

от вида продуцента и типа исходной культуры. 32

Модуль 2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ И

ПОЛУЧЕНИЕ КОНЕЧНЫХ ПРОДУКТОВ 34

6. Особенности роста микроорганизмов в условиях периодического

культивирования. 34

7. Особенности роста микроорганизмов в условиях непрерывного

культивирования. Хемостат, турбидостат, оксистат. Сравнительная

характеристика, применение. 38

8. Характеристика микроорганизмов, осуществляющих синтез витаминов,

ферментов, аминокислот. Виды сырья. Значение продуктов. 40

9. Характеристика микроорганизмов, осуществляющих биосинтез

антибиотиков. Получение полусинтетических антибиотиков. Развитие

антибиотической промышленности. 53

10. Биопрепараты – продукты биотехнологических производств. 58

Список использованных источников 62

ПРЕДИСЛОВИЕ

Настоящий курс по дисциплине «Основы биотехнологического производства» предназначен для студентов бакалавриата, обучающихся по специальности 050701 – биотехнология. В нем детально рассматриваются основные этапы биотехнологических производств: освещены вопросы, касающиеся биообъектов, биохимических процессов и сырья биотехнологических производств. Дана характеристика типов культивирования микроорганизмов, способов выделения и очистки конечных продуктов. Особое внимание уделяется значению методов генной инженерии в современной биотехнологии. Современный этап научно-технического прогресса характеризуется революционными изменениями в биологии, которая становится лидером естествознания. Биология вышла на молекулярный и субклеточный уровень, в ней интенсивно применяются методы смежных наук (физики, химии, математики, кибернетики и др.), системные подходы. Бурное развитие комплекса наук биологического профиля с расширением практической сферы их применения обусловлено также социально-экономическими потребностями общества. Такие актуальные проблемы, стоящие перед человечеством второй половины ХХ века, как дефицит чистой воды и пищевых веществ (в особенности белковых), загрязнение окружающей среды, недостаток сырьевых и энергетических ресурсов, необходимость развития новых средств диагностики и лечения, не могут быть решены традиционными методами. Поэтому возникла острая необходимость в разработке и внедрение принципиально новых методов и технологий. Большая роль в решение комплекса этих проблем отводится биотехнологии, в рамках которой осуществляется целевое применение биологических систем и процессов в различных сферах человеческой деятельности.

Цель курса – ознакомить студентов с основными этапами биотехнологических производств, включая: виды сырья; биообъекты – клетки и ферменты, биохимическая активность которых является основой биопроизводств; процессы, лежащие в основе этих производств; выделение, очистка и товарные формы конечных продуктов. Задачи курса - показать уникальные возможности микроорганизмов и разнообразие ферментативных реакций, лежащих в основе биопроизводств; дать характеристику сырья, в том числе, недефицитных вторичных продуктов и отходов ряда производств; ознакомить с методами культивирования микроорганизмов; дать характеристику этапам получения конечных продуктов биотехнологических производств. Биотехнология микроорганизмов является одной из основных отраслей биотехнологии, с которой связано получение многих важных биопрепаратов и продуктов (витаминов, ферментов, полисахаридов, нейтральных продуктов, антибиотиков и других). До появления термина биотехнология эта отрасль промышленности называлась микробиологической, а дисциплины, её изучающие, прикладной микробиологией и промышленной микробиологией. Современная биотехнология микроорганизмов тесно связана с биоинженерией и широко использует её методы.

Студенты должны знать основные свойства продуцентов и требования предъявляемые к ним; принципы культивирования, контроля и управления биотехнологическими процессами, методы селекции промышленных культур, аппаратурное обеспечение процесса, способы получения готовых продуктов.

Студенты должны приобрести практические навыки работы в асептических условиях с культурами микроорганизмов, определять их чистоту. Уметь готовить питательные среды, выращивать посевной материал, уметь определять биомассу и биологическую активность, степень усвоения питательных веществ. Поэтому выполнение лабораторных работ по данной дисциплине не только способствует закреплению теоретических знаний и позволяет получить навыки экспериментальных работ в биотехнологической лаборатории, но и способствует более эффективному усвоению пройденного материала в целом.

Модуль 1.БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОБЪЕКТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВАХ. СЫРЬЕВАЯ БАЗА

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА

РАБОТА 1

Микроорганизмы - основа биотехнологических производств. Метаболические возможности микробных клеток. Многообразие процессов катаболизма и анаболизма

Цель работы

Изучить метаболические возможности микробных клеток и многообразие процессов катаболизма и анаболизма. Освоить метод накопительных культур для выделения микроорганизмов разных физиологических групп.

Теоретические основы

Основным объектом биотехнологии является микробная клетка. По организации клеток, их генетическому аппарату они подразделяются на прокариот и эукариот.

К прокариотам относятся бактерии и сине – зеленые водоросли. Прокариоты имеют простое строение, в клетке нет обособленного ядра, отделённого от цитоплазмы собственной мембраной, отсутствуют цитоплазматические органеллы, прокариотические клетки рибосомы имеют малые размеры, и они рассеяны по всей цитоплазме.

К эукариотам относятся: водоросли, грибы, лишайники, простейшие.

Эукариоты имеют оформленное ядро. В эукариотической клетке имеется хорошо развитая система клеточных мембран (эндоплазматическая сеть), митохондрии, лизосомы, цитоплазма, рибосомы, аппарат Гольжи. В эукариотической клетке рибосомы крупнее и расположены преимущественно на поверхности мембран эндоплазматической сети.

Микробный мир включает в себя вирусы, бактерии, грибы, водоросли, лишайники и простейшие организмы.

Вирусы были описаны в 1892 г. русским исследователем Ивановским. Вирусы относятся к доклеточным организмам, не имеют клеточного строения, способны жить и размножаться только в живых клетках других организмов. Каждая вирусная частица состоит из небольшого количества ДНК или РНК, покрытого плотной белковой оболочкой.

Бактерии покрыты плотной углеводной оболочкой. ДНК расположена в одной хромосоме, имеющий вид кольца, она размещается в цитоплазме. Они делятся на четыре отдела: грациоликуты, фирмикуты, тенерикуты, мендосикуты. Большинство бактерии относятся к первым двум отделам. Бактерии весьма разнообразны по форме и численности:

- шаровидные (диплококки, стрептококки, тетракокки, стафилококки);

- палочковидные (диплобактерии, стрептобактерии);

- извитые.

- по методу окраски (по Грамму) бактерии бывают: грамм - положительные, и грамм - отрицательные;

- по методу дыхания: аэробы (группа организмов, которая нуждается для своей жизнедеятельности в воздушной среде) и анаэробы (группа организмов, для которых воздух является токсичным);

- по способности вызывать заболевания: патогенные и сапрофиты.

Грибы - это эукариоты, их существует свыше 100 тыс. видов, бывают: макромицеты (шляпочные) и микромицеты (дрожжи). Их отличительный признак: образование нитей (гифы), которые образуют грибницу. Бывают: одноклеточные и многоклеточные.

Основные признаки характерные для грибов:

- отсутствие пигментов;

- наличие хитинок в оболочке;

- в качестве запасного вещества, в клетках грибов накапливается животный крахмал – гликоген. Классификация грибов: Chutriotomycetes, Oomycetez, Zygomucetes, Ascomycetes, Basidiomycetes, Fungi imperfecte.

Водоросли обитают обычно в морских, пресных и океанических водах, подразделяются на: золотистые водоросли, жёлто- зеленые водоросли, диатомовые водоросли, эвгленовые водоросли, красные водоросли, бурые водоросли, зеленые водоросли. В целом к каждому отделу водорослей относится до 100 тыс. видов.

Все биотехнологические процессы в биотехнологии микроорганизмов основываются на функционировании микробных клеток, поэтому биотехнология начинается с познания живой клетки и законов управления процессами жизнедеятельности .

Живая клетка - сложный химический реактор, в котором протекает более 1000 независимых реакций, катализируемых ферментами. Тем не менее биологической системы подчиняются тем же основным законам сохранения вещества и энергии и тем же принципам, что и процессы химической технологии . Микроорганизмы могут усваивать световую энергию - фототрофы и химическую - хемотрофы .Гетеротрофы могут усваивать только органические вещества , а афтотрофы - неорганические вещества (например СО₂) . Полученная энергия хранится и транспортируется внутри клетки в виде высокоэнергетических соединений типа АТФ , а клетки используют энергию для выполнения 3-х функций : для роста, для синтеза больших, сложных молекул, транспорта ионных и нейтральных соединений, механической работы, то есть деление и передвижения. Эффективность использования энергии в биосинтезе высокая ,остальная энергия превращается в тепло.

Метаболизм – это совокупность всех химических превращений клетки. Метаболизм складывается из катаболизма (распад веществ, разложение химических веществ для получения энергии), анаболизма (образования сложных веществ клетки из простых, с затратами энергии) и амфиболизма (все реакции промежуточного обмена ).

Микроорганизмы бывают аэробные (требуется О₂ для дыхания) и анаэробные (существуют без кислорода). При анаэробном расщеплении (брожении ) органические вещества не разлагаются до простых конечных, поэтому энергии высвобождается мало. При аэробном обмене (дыхании ) получаются бедные энергией конечные продукты (СО₂ и Н₂О) и высвобождается много энергии .

Брожение (спиртовое):

С₆Н₁₂О₆ + 2Н₃РО₄ + 2АДФ = 2С₂Н₅ОН + 2АТФ +2СО₂

Дыхание

С₆Н₁₂О₆ + 6О₂ + 36Н₃РО₄ + 36АДФ = 6СО₂ + 6Н₂О + 36АТФ + 36Н₂О

Таким образом, из 1 моля глюкозы при дыхании образуется 36 моль АТФ и 2847 кДж, а при анаэробном процессе только 2 моль АТФ и 217 кДж, то есть в 18 раз меньше. Поэтому в аэробных условиях рост клеток более эффективен. При дыхании водород, получаемый в результате гликолиза, транспортируется к кислороду. В результате гликолиза из одной молекулы глюкозы образуется по две молекулы пирувата, АТФ и NADH2. Пируват подвергается окислительному декарбоксилированию при участии мультиферментного комплекса и нескольких коферментов. Один кофермент принимает отщеплённый водород, а другой кофермент А(СоА-Н) присоединяет оставшуюся ацетильную группу СоСН₂. При дыхании ацетильный остаток полностью расщепляется в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК) в результате окисления и отщепления Н, декарбоксилирования (отщепления СО₂) и гидратации (присоединения Н₂О). Основную энергию для синтеза АТФ при дыхании клетка получает в результате окисления кислородом водорода, получаемого в результате гликолиза, окисления пирувата и реакции ЦТК. Последняя стадия катаболизма – окислительное фосфорилирование. В ходе этого процесса высвобождается большая часть метаболической энергии, при этом молекулы NADH и FADH2 переносят электроны от молекулы питательных веществ к молекуле О ₂. Фосфорилирование осуществляется в дыхательной цепи под воздействием фермента АТФ-синтетазы. В цепи дыхания при переносе Н от NAD H к О₂ освобождается 218 кДж на 1 моль NAD H.

Потребность в энергии удовлетворяется либо за счет световой энергией в процессе фотосинтеза , либо за счет окисления неорганических веществ (H₂S,NH₃ и др. ) в процессе хемосинтеза. Фотосинтез-преобразование энергии света в химическую, которая накапливается в форме АТФ и водорода связанного с коферментом (NAD H). Он состоит из 2-х процессов: светового – преобразования энергии, фотонов hv и темнового образования углеводов. Восстановитель Н₂ образуется при разложении Н₂О при фотосинтезе:

12Н₂О hv 12 Н₂+6О₂+АТФ

АТФ синтезируется при прохождении электронов по цепи транспорта электронов

6СО₂+12Н₂ в темноте С₆Н₁₂О₆+6Н₂О.

Бактериальные и растительные клетки сами синтезируют все 20 аминокислот, входящих в состав белков (в зеленых клетках в хлоропластах). Гетеротрофная ассимиляция сводится, в основном, к процессам перестройки молекул, иногда организму достаточного только одного органического вещества, чтобы синтезировать все необходимые соединения, другие же организмы должны получать совершено определённые, незаменимые вещества, например, аминокислоты и витамины и др.

Механизмы регуляции возникли в процессе эволюции для обеспечения высокой экономичности биохимических процессов. ДНК дает информацию о необходимых ферментах для осуществления определённого метаболизма. Регуляция метаболизма –это управление скоростью биохимических процессов путём обратимого изменения количества белковых посредников, участвующих в этих процессах, или их активности. Белковые посредники - это обычно ферменты – катализаторы химических реакций. Но некоторые процессы, например, транспорт многих субстратов через биологические мембраны, осуществляется белками, которые не катализируют каких-либо химических превращений, а обуславливают узнавание и транс локацию субстратов. Поэтому надо рассматривать два основных уровня регуляции:

Уровень регуляции биосинтеза белковых посредников на этапах репликации, транс крипции и трансляции.

Уровень регуляции их активности в процессе функционирования .

Изменение количества синтезируемых ферментов в клетке идёт в результате действия механизмов индукции и репрессии. Индукция-процесс увеличения количества ферментов в клетке под влиянием субстрата (индуктора). Репрессия – в процессе уменьшения скорости биосинтеза какого – либо фермента при помощи специальных веществ репрессоров. Ими может быть конечный продукт реакций.

Факультативные анаэробы способны к активной жизни в анаэробных и аэробных условиях (дрожжи). Эффект Пастера заключается в торможении процесса брожения дыханием, если создать аэробные условия (в анаэробных условиях идёт спиртовое брожение, а дрожжи почти не размножается или размножаются слабо, а в аэробных условиях идёт процесс дыхания и клеточная биомасса быстро растёт).

Химические реакции которые идут с выделением энергии называются экзоргоническими, а реакция с поглощением энергии - эндергоническими.

Основными элементами, слагающими биотехнологические процессы, являются: биологический агент, субстрат, аппаратура и продукт.

Биологический агент является активным началом в биотехнологических процессах и одним из наиболее важных ее элементов. Номенклатура биологических агентов бурно расширяется, но до настоящего времени важнейшее место занимает традиционный объект – микробная клетка (таблицы 1 и 2).

Микробные клетки с различными химико-технологическими свойствами могут быть выделены из природных источников и далее с помощью традиционных (селекция, отбор) и новейших методов (клеточная и генетическая инженерия) существенно модифицированы и улучшены. При выборе биологического агента и постановке его на производство прежде всего следует соблюдать принцип технологичности штаммов. Это значит, что микробная клетка, популяция или сообщество особей должны сохранять свои основные физиолого-биохимические свойства в процессе длительного ведения ферментации. Промышленные продуценты также должны обладать устойчивостью к мутационным воздействиям, фагам, заражению посторонней микрофлорой (контаминации); характеризоваться безвредностью для людей и окружающей среды, не иметь при выращивании побочных токсичных продуктов обмена и отходов, иметь высокие выходы продукта и приемлемые технико-экономические показатели.

В настоящее время многие промышленные микробные технологии базируются на использовании гетеротрофных организмов, а в будущем решающее место среди продуцентов займут автотрофные микроорганизмы, не нуждающиеся для роста в дефицитных органических средах, а также экстремофилы – организмы, развивающиеся в экстремальных условиях среды (термофильные, алкало- и ацидофильные).

В последние годы расширяется применение смешанных микробных культур и их природных ассоциаций. По сравнению с монокультурами, микробные ассоциации способны ассимилировать сложные, неоднородные по составу субстраты, минерализуют сложные органические соединения, имея повышенную способность к биотрансформации, имеют повышенную устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов среды и токсических веществ, а также повышенную продуктивность и возможность обмена генетической информацией между отдельными видами сообщества. Основные области применения смешанных культур – охрана окружающей среды, биодеградация и усвоение сложных субстратов.

Особая группа биологических агентов в биотехнологии – ферменты, так называемые катализаторы биологического происхождения. Ферменты находят все большее применение в различных биотехнологических процессах и отраслях хозяйствования, но до 60-х годов это направление сдерживалось трудностями их получения, неустойчивостью, высокой стоимостью. Как отдельную отрасль в создании и использовании новых биологических агентов следует выделить иммобилизованные ферменты, которые представляют собой гармонично функционирующую систему, действие которой определяется правильным выбором фермента, носителя и способа иммобилизации. Преимущество мобилизованных ферментов в сравнении с растворимыми заключается в следующем: стабильность и повышенная активность, удержание в объеме реактора, возможность полного и быстрого отделения целевых продуктов и организации непрерывных процессов ферментации с многократным использованием биологического агента. Иммобилизованные ферменты открывают новые возможности в создании биологических микроустройств для использования в аналитике, преобразовании энергии и биоэлектрокатализе.

Большое внимание в настоящее время уделяется получению новейших биологических агентов – трансгенных клеток микроорганизмов, растений, животных генноинженерными методами. Развиты также новые методы, позволяющие получать искусственные клетки с использованием различных синтетических и биологических материалов (мембраны с заданными свойствами, изотопы, магнитные материалы, антитела).

Для выделения микроорганизмов определенных физиологических групп Виноградским и Бейеринком предложена техника так называе­мых «накопительных культур». Техника накопительных культур осно­вана на использовании элективных методов культивирования, т е. соз­дания таких условий при культивировании (наличие определенного ис­точника углерода и энергии, азота, рН, аэрации, освещенности, кон­центрации элементов питания и др.), которые будут благоприятны для развития микроорганизмов определенной физиологической группы, а другие организмы в этих условиях не могут размножаться или их рост будет весьма незначителен.

Так, подбирая определенный состав питательной среды и парамет­ры культивирования и инокулируя среду какими-либо природными суб­стратами (почва, ил, вода) или техногенными (активный ил, сточные воды и т. п.), содержащими разнообразные микроорганизмы, можно получить накопительную культуру микроорганизмов, характеризую­щихся определенными физиолого-биохимическими свойствами, напри­мер, способных окислять определенные органические субстраты, разви­ваться при определенном рН и температуре, способных фиксировать азот атмосферы и окислять неорганические соединения и др. в результа­те преимущественного развития микроорганизмов, приспособленных к данным условиям. Последовательные частые пересевы на такую же элективную жидкую среду предотвращают рост сопутствующих микро­организмов, которые могли бы использовать продукты метаболизма или даже автолиза первичной культуры и, таким образом, позволяют полу­чить обогащенную накопительную культуру.

При получении накопительных культур лучшим материалом для инокуляции служат субстраты, в которых происходит естественное «обо­гащение». Так, например, для выделения микроорганизмов, окисляющих нефтепродукты, - это почвы, загрязненные нефтью; для выделения мик­роорганизмов, способных использовать органические соединения, загряз­няющие сточные воды химических производств, - пробы сточных вод этих же производств или почвы, загрязненные этими стоками и т. п.

О получении накопительной культуры судят визуально, по прояв­лению признаков роста микроорганизма: помутнению среды, появлению пленки, осадка, пигментов, выделению газообразных веществ и т. д.

Из накопительных культур выделяют чистую культуру микроорга­низмов.

Таблица 1 - Микрооорганизмы, используемые в промышленности для получения целевых продуктов

Организм	Тип	Продукт
Saccharomyces cerevisiae	Дрожжи	Пекарские дрожжи, вино, эль, саке
Streptococcus thermophilus Propionibacterium shermanii	Бактерии Бактерии	Иогурт Швейцарский сыр
Gluconobacterium suboxidans	Бактерии	Уксус
Penicillium roquefortii	Плесень	Сыры типа рокфора
Aspergillus oryzae	Плесень	Саке
Saccharomyces cerevisiae	Дрожжи	Этанол
Clostridium acetobutylicum	Бактерии	Ацетон
Xanthomonas campestris	Бактерии	Полисахариды
Corynebacterium glutamicum	Бактерии	L-Лизин
Candida utilis	Дрожжи	Микробный белок
Propionibacterium	Бактерии	Витамин В12
Aspergilus oryzae	Плесень	Амилаза
Kluyveromyces fragilis	Дрожжи	Лактаза
Saccharomycopsis lipolytica	Дрожжи	Липаза
Bacillus	Бактерии	Протеазы
Endothia parasitica	Плесень	Сычужный фермент
Leocanostoc mesenteroides	Бактерии	Декстран
Xanthomonas campestris	Бактерии	Ксантан
Penicillium chrysogenum	Плесень	Пенициллины
Chehalosporium acremonium	Плесень	Цефалоспирины
Rhizopus nigricans	Плесень	Трансформация стероидов
Гибридомы	–	Иммуноглобулины и моноклональные антитела
Клеточные линии млекопитающих	–	Интерферон
E. coli (рекомбинантные штаммы)	Бактерии	Инсулин, гормон роста, интерферон
Blakeslea trispora	Плесень	-Каратин
Phaffia rhodozyma	Дрожжи	Астаксантин
Bacillus thuringiensis	Бактерии	Биоинсектициды
Bacillus popilliae	Бактерии	Биоинсектициды

Таблица 2 - Важнейшие группы субстратов, биологических агентов и образуемых в биотехнологических процессах продуктов

Субстраты	Биологические агенты	Продукты
Меласса, сок сахарного тростника, гидролизаты растительных полимеров.	Микроорганизмы, растительные и животные клетки, в том числе потической инженерии.	Биоудобрения и биоинсектициды, микробные биомассы, диагностикумы, вакцины.
Сахара, спирты, органические кислоты. Парафины нефти. Полупродукты, предшественники биотрансформации. Природный газ, водород. Отходы с/х и лесной промышленности. Отходы промышленности, в том числе переработки фруктов и овощей. Бытовые отходы, сточные воды. Молочная сыворотка. Картофель, зерно. Зеленая биомасса растений.	Вирусы. Компоненты клеток: мембраны, протопласты, митохондрии, ферменты. Внеклеточные продукты: ферменты, коферменты. Иммобилизованные клетки микроорганизмов, растений и животных, их компоненты и внеклеточные продукты.	Биогаз. Чистые продукты, медикаменты, диагностикумы. Гормоны и др. продукты биотрансформации Органические кислоты. Полисахариды. белок одноклеточных. Пищевые продукты. Экстракты, гидролизаты. Спирты, органические растворители. Антибиотики Аминокислоты. Ферменты, витамины. Металлы, неметаллы. Моноклональные антитела.

Методика выполнения работы

Получение накопительной культуры картофельной палочки

Картофельная палочка широко распространена в природе, особен­но на картофеле, куда она попадает из почвы. Картофельная палочка образует очень стойкие центральные споры, которые выдерживают на­гревание при 100° С в течение 6 ч.

Накопительную культуру картофельной палочки получают сле­дующим образом: очищенный картофель нарезают ломтиками, поме­щают в чашки Петри и прогревают 10 мин при 100° С в стерилизаторе (инактивируются все вегетативные клетки микроорганизмов), после чего помещают в термостат на 2-3 дня при 25-30° С. На картофеле про­растают споры и образуется крепкая морщинистая пленка, при микроскопировании которой видны подвижные папочки длиной до 4-5 мкм, часто соединенные в цепочки.

Получение накопительной культуры молочнокислых бактерий

Общим признаком молочнокислых бактерий является способность осуществлять сбраживание углеводов (моно- и дисахаров) с образова­нием молочной кислоты (молочнокислое брожение). Инокулятом для получения накопительных культур молочнокис­лых бактерий могут служить кисломолочные продукты. В качестве питательной среды используют стерильное молоко. В пробирку со стерильным молоком вносят 1 мл кислого молока или друго­го молочнокислого продукта. Пробирку с посевом и контрольную (со стерильным молоком) ставят в термостат при 30—32° С. Через 24 ч отме­чают свертывание молока, характер роста микроорганизмов (образование сгустка - плотного, рыхлого, слизистого), газообразование. Далее прово­дят микроскопирование препарата фиксированных клеток, приготовлен­ного из культуральной жидкости. Отмечают морфологические особенно­сти бактериальных клеток: форму, спорообразование, подвижность и т. д.

Учитывая особенность субстрата (молока), препарат фиксирован­ных клеток готовят следующим образом: на предметное стекло из про­бирки наносят каплю культуральной жидкости, которую равномерно размазывают покровным стеклом. Мазок высушивают на воздухе, фик­сируют и одновременно обезжиривают смесью спирта и эфира (1:1) в течение 10 мин, которую наносят непосредственно на мазок. После ис­парения смесь наливают повторно. Высушенный мазок окрашивают синькой Лефлера.

Получение накопительной культуры углеводород окисляющих микроорганизмов

Углеводороды в качестве единственного источника углерода и энергии могут использоваться широким кругом микроорганизмов среди бактерий и дрожжей, относящихся к разным систематическим группам.

Углеводородокисляющие микроорганизмы широко распростране­ны в природе. Их распространение не связано строго с присутствием нефти и нефтепродуктов в местах их обитания. Однако при наличии нефти и нефтепродуктов в природных субстратах наблюдается естест­венное обогащение их микроорганизмами, активно использующими углеводороды для роста. Из углеводородов наиболее доступны для микроорганизмов н-алканы с числом атомов углерода С10-С18. Для окисления углеводородов микроорганизмам необходима хо­рошая аэрация питательной среды.

Для получения накопительной культуры углеводородокисляющих микроорганизмов в качалочную колбу на 750 мл вносят 100 мл синтети­ческой минеральной среды следующего состава (г/л):

аммоний фосфорнокислый однозамещенный 10

калий фосфорнокислый двузамещенный 10

магний сернокислый-7Н₂О 0,7

железо сернокислое-7Н2О 0,013

цинк сернокислый-7Н₂О 0,012

марганец сернокислый-7Н₂О 0,012

Для получения накопительной культуры углеводородокисляющих бактерий устанавливают рН 6,8-7,0, углеводородокисляющих дрожжей - 4,5-5,0.

В колбу вносят 2 мл жидкого н-парафина и инокулируют небольшим количеством почвы, загрязненной нефтепродуктами. Колбу помещают на качалку (200-300 об/мин) в термостат при 30-32° С на 3-5 суток.

Наличие смеси углеводородов (н-парафина) в среде в качестве един­ственного источника углерода и хорошая аэрация способствуют развитию углеводородокисляющих микроорганизмов, а различное значение рН среды определяет преимущественное развитие либо бактерий, либо дрожжей. После инкубации через 3-5 суток отмечают и записывают из­менения, которые произошли со средой, и микроскопируют.

При получении бактерий готовят фиксированный препарат и микроскопируют, а при получении дрожжей - препарат «раздавленная капля», окрашенный метиленовой синью, и микроскопируют с объективом 40х.

Получение накопительной культуры маслянокислых бактерий

Маслянокислые бактерии сбраживают углеводы (глюкозу, сахаро­зу, крахмал) с образованием масляной кислоты. Кроме масляной кисло­ты образуется некоторое количество уксусной кислоты, водорода и уг­лекислоты. Маслянокислые бактерии строгие анаэробы, поэтому при их куль­тивировании необходимо создавать условия, которые обеспечивают отсутствие кислорода. Для получения накопительной культуры маслянокислых бактерий в большую пробирку (емкостью 50 мл) помещают несколько кусочков неочищенного картофеля, четверть чайной ложки мела, заливают водо­проводной водой (расстояние до пробки 2-3 см), закрывают ватной пробкой и пастеризуют при 80° С в течение 10 мин в водяной бане, по­сле чего помешают в термостат при 37° С. Через 1-2 сут в жидкости на дне пробирки при микроскопировании обнаруживается большое количество подвижных палочек. Отличитель­ной особенностью маслянокислых бактерий является их способность накапливать в клетках запасное вещество - гранулезу, а также образо­вывать споры. При спорообразовании клетки утолщаются либо в сере­дине (клостридиальный тип), либо на конце клетки (плектридиальный тип). После созревания спор гранулеза в клетках исчезает.

После 5-6 дней культивирования анализируют накопительную культуру. Для приготовления микроскопического препарата культуральную жидкость с микроорганизмами берут пипеткой со дна пробир­ки, вблизи ломтиков картофеля. Для обнаружения в культуральной жидкости масляной кислоты проводят две качественные реакции:

1. В сухую чистую пробирку вносят 3-5 мл культуральной жидко­сти, взятой из середины пробирки с накопительной культурой. Добав­ляют 1-2 мл 5 %-ного раствора хлорного железа. Слегка подогревают. Наблюдают появление кирпично-бурого окрашивания из-за образова­ния маслянокислого железа.

2. В сухую чистую пробирку вносят 3-5 мл культуральной жидко­сти, взятой из середины пробирки с накопительной культурой. Добав­ляют 1-2 мл 96 %-ного этилового спирта, 1 мл концентрированной сер­ной кислоты.

После охлаждения пробирки обнаруживают ананасный запах обра­зовавшегося масляноэтилового эфира. Для обнаружения гранулезы в клетках маслянокислых бактерий на каплю культуральной жидкости с бактериями наносят на 5-10 мин кап­лю концентрированного раствора Люголя, после чего накрывают по­кровным стеклом (витальный препарат) и микроскопируют. Гранулеза окрашивается в темно-коричневый цвет.

Задание 1

Получить накопительную культуру картофельной палочки. Опи­сать характер роста. Приготовить препарат фиксированных клеток и промикроскопировать. Объектив 100х. Зарисовать.

Задание 2

Получить накопительную культуру молочнокислых бактерий из кислого молока, ацидофилина либо кефира. Описать характер рос­та. Приготовить препарат фиксированных клеток. Промикроскопи­ровать. Объектив 100х. Зарисовать.

Задание 3

Получить накопительные культуры углеводородокисляющих мик­роорганизмов бактерий и дрожжей. Описать характер роста. При­готовить препараты разбавленной капли (дрожей) и фиксирован­ных клеток (бактерий). Промикроскопировать.Объектив 100х и 40х. Зарисовать.

Задание 4

Получить накопительную культуру маслянокислых бактерий. Опи­сать характер роста. Приготовить и промикроскопировать препарат фиксированных клеток. Объектив 100х.

Провести окраску клеток на наличие гранулезы с помощью раство­ра Люголя (витальный препарат). Промикроскопировать. Объектив 100х. Провести качественную реакцию на образование масляной кислоты с хлорным железом и этиловым спиртом. Записать уравнение реакции.

Контрольные вопросы

1.Микроорганизмы - основа биотехнологических производств.

2.Метаболические возможности микробных клеток.

3.Многообразие процессов катаболизма и анаболизма

4.Получение накопительной культуры картофельной палочки

5.Получение накопительной культуры маслянокислых бактерий

6.Получение накопительной культуры молочнокислых бактерий

7.Получение накопительной культуры углеводород окисляющих микроорганизмов

РАБОТА 2

Сырьевая база биотехнологического производства.

Приготовление и стерилизация питательных сред

Цель работы

Ознакомиться с принципами составления питательных сред для культивирования микроорганизмов, освоить методику приготовления питательных сред для производства кормовых биопрепаратов «Уробактерин» и «Биовит» в соответствии с промышленным регламентом.

Теоретические основы

В микробиологической практике для выращивания микроорганизмов используют разнообразные питательные среды, которые по составу подраз­деляют на естественные или натуральные, полусинтетические и синтети­ческие среды.

Натуральные среды состоят из продуктов растительного и животного происхождения - мяса, молока, картофеля, моркови и т.п. Примерами натуральных сред являются:

• мясо-пептонный бульон, состоящий из экстракта мяса (500 г мяса на 1 л воды), 0,5% NaCl и 1% пептона (продуктов неполного разложения белка);

• неохмеленное пивное сусло, приготовляемое на основе солода (пророс­ших зерен ячменя), гидролизованного до сахаров;

• дрожжевая среда, состоящая из экстракта дрожжей (7-10 г сухих дрожжей на 1 л воды)), к которому добавляют углеводы (1-2%), минеральные соли К₂НРО₄ (0,1%) и NaCl (0,5%);

• картофельная среда, которая готовится путем отвара картофеля (200 г кар­тофеля на 1 л воды) и др.

На натуральных средах хорошо развиваются микроорганизмы, так как в таких средах имеются, как правило, все компоненты, необходимые для их роста.

Полусинтетические среды в своем составе наряду с соединениями из­вестной химической природы содержат вещества неопределенного состава.

К полусинтетическим средам относят мясопептонный бульон с глюкозой и фосфорнокислым калием, картофельную среду с глюкозой и пептоном, а также среды известного состава с добавкой различных факторов роста (гид-ролизата казеина, дрожжевого автолизата, кукурузного экстракта и т.д.)

Приготовление мясо-пептонного бульона (МПБ)

Мясо освобождают от костей, жира, пленок и сухожилий, пропускают через мясорубку, заливают двух- или четырехкратным количеством водопро- водной воды (по весу) и кипятят в течение часа. Жидкость фильтруют через вату или полотно, затем через фильтровальную бумагу. Фильтрат измеряют и доливают до первоначального объема дистиллированной водой. Разливают по бутылям и стерилизуют при 120° С в течение 30-40 минут.

Приготовление дрожжевого автолизата

Дрожжевой автолизат используют для приготовления основного пита­тельного субстрата в плотных агаровых средах. Хлебные и пивные дрожжи содержат 40-60% азотистых веществ, а также ряд ферментов, способствую­щих их самоперевариванию. Дрожжевые среды обеспечивают пышный рост, несмотря на низкое содержание общего азота и слабую степень его расщепления.

Прессованные пекарские дрожжи нарезают небольшими кусками и за­кладывают в бутыли с таким расчетом, чтобы автолизат занимал около 1/5 вместимости бутыли (4 кг дрожжей на 20-литровую бутыль). Бутыль с дрож­жами ставят на двое суток в термостат при температуре около 60°С. По мере разжижения дрожжей бутыль встряхивают для равномерного прогревания содержимого (1-2 раза в сутки). Конец автолиза характеризуется полным разжижением дрожжей. Автолизат должен иметь коричневый оттенок и при­ятный запах.

По окончании автолиза в бутыль добавляют тройное (по исходной массе дрожжей) количество теплой водопроводной воды (на 4 кг дрожжей 16л во­ды). Разведенный автолизат помещают в автоклав для стерилизации при 1-1,3 атм (120-123°С) на 30 мин. Оставляют на несколько дней (5-10) для от­стаивания.

Синтетические среды — это среды, в состав которых входят известные химические соединения в определенных концентрациях.

Например, состав среды Чапека для культивирования грибов следую­щий: глюкоза - 30 г; азотнокислый натрий - 2 г; фосфорнокислый калий -1 г; сернокислый магний - 0,5 г; хлористый калий - 0,5 г; сернокислое желе­зо - 0,01 г; вода - 100 мл.

При подготовке питательных сред в лабораторных условиях состав среды и способ ее приготовления может меняться в зависимости от обстоя­тельств (например, один компонент среды может быть заменен равноценным по свойствам компонентом). На производстве питательные среды готовятся в строгом соответствии с промышленным регламентом. Простерилизованная среда должна иметь четко ограниченные показатели.

Уробактерин

Кормовой препарат уробактерин, используемый для обогащения комби­кормов в качестве белкововитаминных добавок, представляет собой бактериальный препарат, получаемый микробиологическим способом на основе чис­тых культур уробактерий. Продуцентом уробактерина является спорообразующий микроб Вас. Serrulatus штамм П2 - 128, который выделен из садовой почвы и характеризуется уреазной активностью, интенсивным накоплением биомассы на безбелковой минеральной среде (выход бактериальных клеток доходит до 15 млрд.микробных тел в 1 мл. среды), образованием 5 витаминов группы В (В₃, В₅, В₆, В₇, B₈) и 11 свободных аминокислот - фенилаланила, гистидина, триптофана, метионина, лизина, лейцина, аргинина, тирозина, цистина, серина, глицина. Образование указанных физиологически ак­тивных веществ для Вас. Serrulatus - генетический признак.

Вас. Serrulatus усваивает в качестве источников азота мочевину, азотно­кислый натрий, азотнокислый калий, пептон, а углерода — лимоннокислый натрий, сахарозу, арабинозу, яблочнокислый калий.

Способы стерилизации посуды и питательных сред

Основываясь на влиянии внешних условий на микроорганизмы, в микробиологической практике разработан ряд приемов, приводящих микроорганизмы к гибели. Одним из таких приемов является стерилизация.

Под стерилизацией (обеспложиванием) понимают полное уничтожение микроорганизмов и их спор в питательных средах, посуде, на инструментах и других предметах лабораторного оборудования. Для этого наиболее часто пользуются воздействием высокой температуры.

Стерилизация обжиганием на пламени горелки

Небольшие стеклянные (палочки, шпатель) и металличе­ские предметы (игла, петля, пинцет, скальпель) проводят не­сколько раз через пламя горелки. Стерилизация достигается обугливанием находящихся на их поверхности микроорганиз­мов. Обжиганием па пламени пользуются для стерилизации по­верхности ватных пробок, горла посуды.

Стерилизация кипячением

Стерилизацию металлических инструментов и резиновых трубок проводят кипячением. Так как споры некоторых бакте­рий сохраняют жизнеспособность при кипячении в воде в те­чение нескольких часов, то рекомендуется стерилизацию кипя­чением проводить в 2%-ном растворе карбоната натрия в тече­ние 10 мин. В этих условиях споры погибают.

Стерилизация сухим жаром

Сухим жаром стерилизуют в основном стеклянную посуду. При этом пробирки, колбы предварительно закрывают ватны­ми пробками. Чтобы избежать заражения простерилизованных предметов из воздуха, их перед стерилизацией заворачивают в оберточную бумагу, а вынимают только перед ра­ботой.

Пипетки заворачивают полоской бумаги шириной 2,5—3,0 см. Предварительно в конец пипетки, который берут в рот, вклады­вают ватный тампон. Капиллярный конец пипетки кладут на полоску бумаги под углом 45° и заворачивают по спирали.

Чашки Петри заворачивают в бумагу в форме квадрата. Чашку Петри помещают на середину листа, загибают его с двух противоположных сторон кверху, края дважды загибают швом. Два свободных конца загибают вниз. При таком оберты­вании у чашек легко различать верх и низ. Подготовленную таким образом посуду помещают в сушильный шкаф, в котором нагревают ее при температуре 160—170 °С в течение 2 ч. При таком нагревании погибают не только бактерии, но и их споры. Температуру в сушильном шкафу выше 175°С допускать не следует, так как при этом ватные пробки буреют, а бумажная обертка становится ломкой.

Стерилизация текучим паром. Дробная стерилизация или тиндализация

Питательные среды (молоко, солод, желатин), воду, рези­новые трубки и другие предметы, портящиеся от действия сухо­го жара, подвергают стерилизации текучим паром. Стерилиза­цию текучим паром производят в кипятильнике Коха или в автоклаве с открытым вентилем. Воду в них доводят до кипе­ния, и образующийся пар обтекает стерилизуемые объекты. Температура стерилизуемых питательных сред достигает 100°С. Нагревание в течение 30—45 мин приводит к гибели вегета­тивных клеток бактерий, но споры их не погибают. На следую­щий день нагревание повторяют. При этом погибают вегетатив­ные клетки, развившиеся из спор. Для обеспечения полной сте­рильности жидкость оставляют еще на сутки и снова повторяют нагревание. Такую стерилизацию называют дробной или тиндализацией.

Пастеризация

В основе пастеризации лежит нагревание жидкостей до тем­пературы меньше 100°С. Цель её — уничтожение неспороносных бактерий в жидкостях, теряющих питательные свойства при кипячении (молоко, пиво, вино и др.). Осуществляется па­стеризация нагреванием жидкостей при 60 °С в течение 30 минут или при 75^оС в течение 15 минут, или при 80°С в тече­ние 10 минут.

Холодная стерилизация

Органические жидкости, не выносящие нагревания, освобож­дают от бактерий, пропуская через стерильные мелкие пористые фильтры. Эти фильтры назы­вают бактериальными фильтрами. Они задерживают микроорганизмы.

Бактериальные фильтры имеют разные номера. Фильтры № 1 имеют средний диаметр пор 0,3 мкм, они наиболее на­дежны. Фильтры № 5 имеют самые большие отверстия пор, диаметром 1,2 мкм.

Перед употреблением мембранные фильтры стерилизуют ки­пячением. Фильтры помещают в теплую дистиллированную во­ду и кипятят 30 минут, меняя ее 2-3 раза.

Стерилизация в автоклаве паром под давлением

Наиболее падежный и универсальный метод стерилизации питательных сред и материалов — стерилизация их насыщен­ным паром под давлением. Производят ее в автоклаве, в кото­ром стерилизуемые объекты нагревают чистым насыщенным па­ром при давлении выше атмосферного. Когда насыщенный пар встречается с более холодным объектом, он конденсируется, превращаясь в воду. При конденсации выделяется большое количество теплоты, и температура стерилизуемого объекта бы­стро повышается.

Полная стерилизация питатель­ных сред при 120°С и давлении 1 атм обеспечивается нагреванием в течение 20 мин.

Методика выполнения работы

Материалы и оборудование

Колбы Эрленмейера, автоклав, мочевина, саха­роза, КН₂РО₄, NaCl, MgSО₄, FeCl₃, мука кукурузная (крахмал 60%), экстракт кукурузный, жир (пеногаситель).

Ход работы

Приготовление питательной среды для производства препарата «Уробактерин»

Вас. Serrulatus - П2-128 выращивают на оптимизированной синтетиче­ской среде Рубенчика в ферментерах с различным объемом следующего состава, г/л:

Мочевина - 7,26

Сахароза - 9,82

КН₂РО₄-1,0

NaCl-1,0

MgSO₄^x7H₂O-l,0

FeCls - следы

Вода (водопроводная) - до 1 литра.

рН- 8,0-8,2

Коэффициент заполнения ферментатора – 0,5 (50%).

Стерилизация среды проводится при 0,5 атм., t - 102-105°С в течение 40минут.

Биовит

Биовит применяют с лечебной и профилактической целью против колибактериоза, сальмонеллезов, гастроэнтероколитов (бактериальной этиологии) телят, поросят, пушных зверей, отечной болезни свиней и колибактериозе птиц.

Для производства биовита, биологически активным веществом которого является антибиотик хлортетрациклин и витамин В12, используется проду­цент хлортетрациклина - споры культуры Act. aureofaciens штамм ТБ 633 ФУ и ТБ 619 ФУ, которые должны иметь продуктивность не менее 6500 ед/мл.

Приготовление питательной среды для производства препарата «Биовит»

Состав среды:

1. Мука кукурузная (крахмал 60%) - 6,0 г/л

2. Экстракт кукурузный (по техническому весу) - 6 г/л

3. Жир (пеногаситель) - 1,0 г/л

4. Вода (водопроводная) - до 1 литра.

рН до стерилизации - 9 - 7,2

рН после стерилизации - 6,3 - 6,6

В ферментер заливают водопроводную воду и нагревают ее до 40-50°С. При работающей мешалке загружают кукурузную муку, перемешивают 30 минут, подогревают до 85-90°С и выдерживают 45 минут, затем загружают кукурузный экстракт. Среду подтитровывают раствором кальцинированной соды до рН 6,6-6,8, задают пеногаситель.

Среду стерилизуют в течение 1 часа при температуре 135°-140°С (2,0 кгс/см ).

Контрольные вопросы

1.Примеры приготовления натуральных, синтетических, полусинтетиче­ских сред.

2. Назначение препарата «Уробактерин». Продуцент уробактерина.

3. Назначение препарата «Биовит». Продуцент биовита.

4. Техника приготовления питательных сред для вышеперечисленных биопрепаратов.

5. Способы стерилизации посуды и питательных сред.

РАБОТА 3

Контроль стерильности питательной среды и воздуха

Цель работы

Изучить и освоить методы контроля стерильности питательной среды и воздуха.

Теоретические основы

Под асептическими условиями культивирования пони­мается возможность проведения этого процесса без пос­торонней микрофлоры. Требование надежной защиты среды, в которой культивируется производственный штамм микроорганизма-продуцента, от посторонней мик­рофлоры является одним из основных в технологии микробиологического синтеза. Особенно важное значе­ние имеет асептика для производств тонкого микробио­логического синтеза. Обеспечение асептических условий в масштабах крупного промышленного производ­ства— весьма сложная инженерная проблема. В целом она решается двумя путями.

Первый путь заключается в обеспечении технологи­ческой гигиены производства. Сюда относится комплекс приемов и средств, обеспечивающих снижение загряз­ненности питательной среды посторонней микрофлорой и препятствующих распространению производст­венных продуцентов по производственным помещениям.

Второй путь объединяет комплекс технических реше­ний и методов, имеющих непосредственное отношение к технологии. Он заключается в использовании специально­го технологического оборудования (фильтры, стерили­заторы) или реализации специфических требований асептики при создании основного технологического обо­рудования (ферментёры), контрольно-измерительных приборов, обвязок аппаратов и разводки трубопроводов. Конечной целью процессов, которые осуществляются с помощью этого оборудования, является стерилизация, т. е. полное освобождение от посторонней микрофлоры всех видов материальных потоков, вводимых в ферментёр (аэрирующий воздух, питательная среда, пеногасители и др.), и его внутренних полостей.

Чтобы процесс культивирования проходил в асепти­ческих условиях, необходимо обеспечить стерилизуемость и герметичность аппаратов и трубопроводов, сте­рильность аэрирующего воздуха, питательной среды и пеногасящего вещества и других добавок, вводимых в ферментёр.

Методика выполнения работы

Вариант I. Микробиологические методы исследования воды и питательной среды

Водные экосистемы являются средой обитания микроорганизмов. Первичными продуцентами служат одноклеточные водоросли. В пище­вую цепь входят бактерии и простейшие. Микрофлора воды чаще всего отражает микробный пейзаж почвы около водоема, постоянно меняется и обновляется, что связано с попаданием различных бактерий с ливне­выми, сточными, талыми водами, с пылью, из организма живущих в водоеме рыб, гниющих растений. Микрофлора в пресных и соленых водоемах различна.

В пресных водоемах (озерах, реках) обнаруживаются кокки (Micro-coccus roseus и др.) и палочковидные бактерии (Pseudomonas fluorescens). Анаэробов в воде мало; в основном они размножаются в иле на дне водоемов, участвуя в биохимических процессах очищения. Сапрофитные микроорганизмы выполняют роль мусорщиков, расщеп­ляя органические отходы, делая их пригодными для метаболических процессов других живых существ.

Микрофлора морей и океанов не так богата и представлена гало-фильными (солелюбивыми) микроорганизмами.

Вода артезианских скважин почти не содержит микроорганизмов, что объясняется фильтрующей способностью почвы.

С ливневыми, талыми и сточными водами в реки и озера попадают микроорганизмы - представители нормальной флоры кишечника человека и животных, например, кишечная палочка, энтерококки, различные клостридии. Вместе с ними могут попасть и патогенные микроорганиз­мы (брюшнотифозные, дизентерийные бактерии, холерные вибрионы, вирусы полиомиелита, гепатита), которые сохраняются от нескольких дней до недель. Именно поэтому водный путь передачи является одним из возможных факторов распространения кишечных инфекций.

Материалы и оборудование

Пробы водопроводной и загрязненной воды, стерильные флаконы и склянки, ватно-марлевые пробки, чашки Петри, питательный агар, МПА.

Ход работы

Отбор проб воды

В зависимости от задачи исследования определяют место и время отбора пробы.

Для исследования воды открытых водоемов, а также колодцев от­бирают пробы воды на глубине 10-15 см от поверхности в стерильные флаконы.

Для отбора проб водопроводной воды используют стерильные склянки вместимостью 500 мл с ватно-марлевыми пробками. Бактерио­логическое исследование отобранных проб должно производиться не позднее 2 часов с момента отбора или не позднее 6 часов при хранении пробы при 1-5°С.

Методы определения микробного числа

В 1 мл исследуемой воды определяют содержание мезофильных аэробов и факультативных анаэробов, способных при 37°С в течение суток на МПА образовывать колонии, видимые невооруженным глазом или при увеличении в 2-5 раз. Из каждой пробы делают посев не менее двух различных объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы число выросших колоний на чашке колебалось от 30 до 300.

При исследовании водопроводной воды в каждую из двух чашек вносят по 0,1-1 мл чистых вод и по 0,001 и 0,01 мл более загрязненных. При определении микробного числа сильно загрязненных вод и сточных жидкостей исследуют по 0,0001 и 0,00001 мл.

Для посева 0,1 мл и меньших объемов исследуемую воду разводят стерильной дистиллированной водой. Готовят последовательно 10-кратные разведения.

По 1 мл каждого разведения вносят в 2 чашки Петри и заливают тонким слоем предварительно растопленного и остуженного до 45°С питательного агара (10-12 мл агара). После интенсивного перемешивания среде дают застыть на строго горизонтальной поверхности. Посевы вы­ращивают при 37°С в течение суток. С лупой при увеличении в 2-5 раз подсчитывают все выросшие колонии. Учитывают результаты только на тех чашках, где число колоний колеблется в пределах от 30 до 300, и про­изводят перерасчет содержания бактерий в 1 мл исследуемой воды.

Общепринятым показателем санитарно-микробиологического ис­следования воды является показатель коли-индекс, т. е. количество бак­терий группы кишечных, палочек в 1 л воды или коли-титр - наимень­шее количество или наибольшее разведение воды, в котором еще обна­руживается кишечная палочка.

Задание

Определить количество микроорганизмов (микробное число) в во­допроводной воде и загрязненных водах.

Вариант II. Микробиологические методы исследования воздуха

Воздух не является средой обитания микроорганизмов, а является транзитной средой. Микрофлору воздуха можно условно разделить на постоянную, часто встречающуюся, и переменную, представители которой, попадая в воздух из свойственных им мест обитания, недолго сохраняют жизне­способность. Постоянно в воздухе обнаруживаются пигментообразующие кокки, палочки, дрожжи, грибы, актиномицеты, спороносные ба­циллы, клостридии и др., т. е. микроорганизмы, устойчивые к свету, высыханию. В воздухе крупных городов количество микроорганизмов больше, чем в сельской местности. Над лесами, морями воздух содер­жит мало микробов (в 1 m³ - единицы микробных клеток). Дождь и снег способствуют очищению воздуха от микробов.

В воздухе закрытых помещений, особенно зимой, при недоста­точном проветривании микробов значительно больше, чем в открытых воздушных бассейнах. Состав микрофлоры и количество микроорга­низмов, обнаруживаемых в 1 m³ воздуха (микробное число воздуха), зависят от санитарно-гигиенического режима, числа находящихся в по­мещении людей, состояния их здоровья и других условий.

В воздух могут попадать и патогенные микроорганизмы от живот­ных, людей (больных и носителей).

Для микробиологического исследования воздуха пользуются мето­дами, в основу которых положены оседание (седиментация) и аспирация. При помощи седиментационных методов можно получить общее пред­ставление о встречающихся в воздухе микроорганизмах. Аспирационные методы дают возможность определить не только качественное, но и ко­личественное содержание бактерий в определенном объеме воздуха.

Материалы и оборудование

Чашки Петри с МПА, сосуд с определенным объемом изотонического раствора NaCl или водопроводной воды, воздуходувка, мембранные фильтры, прибор Кротова.

Ход работы

Метод оседания

Простейший метод бактериологического иссле­дования воздуха - метод оседания, который основан на оседании бактериальных частиц и капель под влиянием силы тяжести на поверхности агара открытой чашки Петри. Чашки с МПА экспонируют 5-10-15 минут в зависимости от предполагаемого бактериального загрязнения. Метод оседания не дает количественного представления о содержании микро­флоры в воздухе, так как на открытых чашках плохо улавливаются тон­кодисперсные фракции бактериальных капель и пылевых частиц, а за­держиваются главным образом крупные пылевые частицы, которые оседают или прибиваются токами воздуха к поверхности среды. Поэто­му перерасчет по Омелянскому (на поверхность 100 см² агара оседает за 5 минут такое количество бактерий, которое содержится в 10 л воздуха) малопригоден для количественного изучения микрофлоры воздуха по­мещений и абсолютно не пригоден для атмосферного воздуха, где имеют место большие колебания в скорости его движения. Тем не менее метод оседания может быть использован в тех случаях, когда отсутствуют бо­лее совершенные приборы и методы или когда нет источника электро­энергии. Для расчета микробного числа воздуха используют следую­щую формулу:

где X- количество микробов в 1 m³ воздуха; а- количество колоний в чашке; в - площадь чашки (см. таблицу 1); t - время экспозиции; 5 - вре­мя экспозиции; 10 - объем воздуха, из которого происходит оседание микробов за 5 минут, л; 100 - площадь, на которую происходит оседание, см²; 1000 - объем воздуха, л.

Таблица 1 - Площадь чашки в зависимости от диаметра

Диаметр чашки, см Площадь чашки, см²

8 50

9 63

10 78,5

Простейшие аспирационные методы основаны на улавливании бактерий жидкостью.Через сосуд с определенным объемом изотонического раствора NaCI или водопроводной воды просасывают (с помощью воздуходувки, пылесоса, насоса и др.) определенный объем воздуха.

Затем проводят высев на МПА по 0,1-0,2 мл улавливающей жид­кости. В случае большего объема полученной суспензии часть улавливающей жидкости профильтровывают через мембранные фильт­ры №2 или №3 с последующим посевом фильтров на поверхность плот­ных питательных сред.

Среди приборов для исследования воздуха помещений самым рас­пространенным является прибор Кротова. Механизм улавливания мик­рофлоры основывается на ударно-прибивном действии струи воздуха, который проходит через узкую клиновидную щель и с большой скоро­стью ударяется о влажную поверхность питательной среды. В результате удара находящиеся в воздухе аэрозоли, в том числе содержащие бакте­рии пылевые частицы и капли, прибиваются к поверхности МПА или элективных сред. Во время отбора пробы воздуха чашка Петри вращает­ся вместе со столиком, благодаря чему достигается равномерное обсеме­нение поверхности агара микрофлорой воздуха. Для отбора проб следует подбирать чашки Петри с плоским дном, а количество питательной сре­ды в чашке не должно превышать 15 мл.

Прибор Кротова характеризуется эффективностью улавливания микрофлоры в пылевой фазе аэрозоля, дает четкие сопоставимые ре­зультаты, прост в работе, позволяет за короткое время произвести отбор проб воздуха непосредственно на чашки Петри с МПА или элективны­ми средами. Производительность прибора - от 20 до 40 л/мин. Основной недостаток прибора состоит в том, что для работы он нуждается в элек­троэнергии. Это ограничивает возможности его применения для иссле­дования атмосферного воздуха.

Для исследования атмосферного воздуха используется ряд прибо­ров, в которых аэрозоль улавливается в жидкую среду. Принцип уст­ройства этих приборов прост. Они представляют собой стеклянные ем­кости, в которых через отверстия в пробке пропущены две трубки. Одна трубка кончается чуть ниже пробки и соединена с аспиратором, другая - опущена на дно цилиндра, куда поступает исследуемый воздух. В ци­линдр наливают стерильный изотонический раствор хлорида натрия или водопроводную воду (жидкости, не образующие пену) и через них про­сасывают определенный объем воздуха. В качестве аспиратора могут быть использованы воздуходувки, пылесосы, насос. Посев жидкости производят на питательный агар или дифференциальные среды. На МПА засевают по 0,1-0,2 мл улавливающей жидкости, а на элективные среды - по 0,3-0,5 мл.

Для исследования атмосферного воздуха используются также приборы-бактериоуловители, т. е. трубки с размещенными в них плотными фильтрами (хлопчатобумажная или стеклянная вата). После окончания отбора пробы воздуха в количестве 100-300 л ватный тампон помещают в склянку с изотоническим раствором хлорида натрия и тщательно от­мывают встряхиванием со стеклянными бусами. Полученную суспензию подвергают бактериологическому анализу посевом на поверхность плотных питательных сред.

Мембранные фильтры

Для бактериологического исследования воздуха могут быть использованы стерилизованные и высушенные мем­бранные фильтры №4. При помощи воздуходувки через фильтр проса­сывают воздух. Мембранные фильтры должны быть хорошо просушены, так как мокрые и даже влажные фильтры практически воздухонепрони­цаемы. Преимуществом метода мембранных фильтров является их пор­тативность и возможность концентрировать на них микроорганизмы из относительно больших объемов воздуха. Мембранные фильтры могут быть использованы при исследованиях атмосферного воздуха в зимних условиях. Для обнаружения вирусов в воздухе наиболее целесообразно ис­пользовать приборы, в которых улавливание вирусного аэрозоля осуще­ствляется в жидкой улавливающей среде. В зависимости от поставленной задачи исследования микрофлоры воздуха и условий отбора проб могут проводиться определения общей бактериальной обсемененности воздуха, содержания санитарно-показательных микроорганизмов и наличия патогенных или условно-патогенных микроорганизмов. Пробы воздуха следует отбирать на уровне дыхания сидящего или стоящего человека.

Задание

Определить содержание микроорганизмов в воздухе лабораторных помещений методом седиментации и с помощью аппарата Кротова.

Вариант III. Микробиологические методы исследования пищевых продуктов и других твёрдых продуктов

Порядок взятия проб, методы их исследования и нормативы каче­ства регламентируются серией ГОСТ или другой нормативно-технической документацией.

Материалы и оборудование

Гомогенизатор или стерильная ступка, стерильная водопроводная вода или изотонический раствор хлорида натрия, стерильный раствор бикарбоната натрия, чашки Петри с МПА.

Ход работы

Исходным материалом для посевов продуктов плотной консистен­ции обычно является 10 %-ная взвесь продукта. Для ее приготовления стерильно взятую из разных мест пробы навеску (обычно 15 г) измель­чают в гомогенизаторе (или растирают в стерильной ступке), прибавляют 135 мл стерильной водопроводной воды или изотонического раствора хлорида натрия. Жидкие и полужидкие продукты тщательно перемешивают, а в случае резко кислой реакции подщелачивают 10% стерильным раствором бикарбоната натрия до рН 7,2-7,4. Жидкий продукт или по­лученную взвесь плотного продукта используют для приготовления ряда десятикратных разведений в зависимости от характера продукта и от предполагаемого обсеменения.

Общую обсемененность или общее количество бактерий в 1 г/мл продукта учитывают по росту колоний мезофильных микроорганизмов на мясо-пептонном агаре.

Контрольные вопросы

1. Что понимается под асептическими условиями культивирования?

2. Одно из основных требований в технологии микробиологического

синтеза.

3. Что такое стерилизация?

4. Как осуществляют отбор проб воды?

5. Какие микроорганизмы обнаружены в микрофлоре воздуха и водных

экосистемах?

6. Методы и приборы микробиологического исследования

воздуха.

7. Какую формулу используют для расчёта микробного числа воздуха?

8. Как учитывают общую обсемененность продукта?

РАБОТА 4

Характеристика микроорганизмов, осуществляющих спиртовое

и молочнокислое брожение.

Цель работы

Изучить процессы спиртового и молочнокислого брожения, научиться практически определять спирт и молочную кислоту.

Теоретические основы

Основные возбудители спиртового брожения, дрожжи, играют большую роль в жизни человека. Дрожжи традиционно используют в хлебопечении, для получения спирта и многих других продуктов. Термином «дрожжи» обозначают одноклеточные эукариотные микроорганизмы, которые в зависимости от наличия и типа полового процесса относят к 3-м классам грибов: Ascomycetes, Basidomycetes и Deutermycetes. К классу Ascomycetes относятся дрожжи, образующие при половом размножении сумки с эндогенными спорами. Класс Basidomycetes включает дрожжи, формирующие телиоспоры и базидоподобные спорофоры с экзогенными половыми спорами (споридиями). К Deutermycetes или несовершенным грибам, относят дрожжи, у которых не обнаружен половой цикл.

В процессе эволюции дрожжи хорошо приспособились к обитанию в различных местах. Они растут на поверхности сладких плодов, в некоторых цветках, в сокотечениях деревьев, на поверхности листьев, в лесной подстилке и почве. Также содержатся в пищеварительном тракте человека и животных.

Из соединений углерода дрожжи, как правило, лучше всего используют гексозы. Из полисахаридов чаще всего утилизируют инулин и крахмал. Известны дрожжи, растущие на средах с углеводородами и некоторыми спиртами, в том числе метанолом и этанолом.

В качестве источника азота дрожжи используют соли аммония, аминокислоты, небольшие пептиды, реже - нитраты и нитриты. Некоторые виды нуждаются в одном или нескольких витаминах, другие – способны все необходимые для роста витамины синтезировать сами. Большинство дрожжей растёт на границах рН от 3 до 8. Оптимальная температура для роста большинства видов , но некоторые расы дрожжей, например, используемые в пивоварении, имеют более низкий температурный оптимум. Многие дрожжи – факультативные анаэробы. В условиях анаэробиоза они получают энергию в результате сбраживания углеводов, а в присутствии молекулярного кислорода – за счёт аэробного дыхания.

Спиртовое брожение у дрожжей до образования пировиноградной кислоты отличается от гликолиза у высших организмов лишь последними этапами, на которых вместо молочной кислоты образуется этиловый спирт. Обусловлено это наличием у дрожжей пируватдекарбоксилазы, катализирующей превращение пирувата в ацетальдегид, который затем восстанавливается в этанол. Гликолитическим путём (фруктофосфатным (ФБР-путь)) осуществляется разложение глюкозы, галактозы, фруктозы и маннозы. Олигосахариды вначале гидролизуются ферментами до гексоз. Разложение пентоз и высших спиртов осуществляется дрожжами через пентофосфатный и ФБР – пути. Спирты вначале дегидрируются до соответствующих гексоз и пентоз. Брожение – это строгое равновесие процессов окисления и восстановления. Поэтому НАД, восстановленный на одном из этапов брожения, должен окисляться на другом этапе. Окисление НАД происходит одновременно с восстановлением ацетальдегида в этанол. Такой процесс Нейберг назвал «первой формой брожения».

С₆Н₁₂О₆ 2СО₂+2С₂Н₅ОН (Глюкоза 2СО₂ + 2Этанол)

Ход брожения может заметно меняться в зависимости от конкретных условий. Если в культуральную жидкость дрожжей добавить бисульфит натрия, который связывает ацетальдегид, он исключается из последующего процесса и блокируется.

СН₃ – СН =О + NaHSO₃ CH₃ – CH(OH) – SO₃Na

В таких случаях акцептором электронов (водорода) от НАДН становится дигидроксиацетонфосфат, он превращается в глицерин-3-фосфат, а затем - в глицерин (вторая форма брожения по Нейбергу).

Глюкоза глицерин + ацетальдегид (связанный) +СО₂

Суммарное количество синтезированной АТФ при такой форме брожения равно нулю, и, следовательно, процесс не может обеспечить рост клеток, но его используют для получения глицерина. В щелочной среде ацетальдегид окисляется НАД-зависимой дегидрогеназой в уксусную кислоту. Образовавшийся НАДН используется для восстановления ацетальдегида в этанол. Одновременно НАДН, получающийся при окислении 3-фосфоглицеринового альдегида, используется для восстановления дигидроксиацетонфосфата в глицерин-3-фосфат, который превращается в глицерин (третья форма брожения по Нейбергу).

Суммарная реакция:

2глюкоза + Н₂О 2глицерин + этанол + уксусная кислота + СО₂

Такой химизм благоприятен для клеток, т.к. уксусная кислота снижает рН среды, после чего возобновляется спиртовое брожение. Дигидроксиацетонфосфат также выполняет роль акцептора электронов до момента, пока не накопится ацетальдегид, необходимый для НАДН. Т.е. в начале брожения существует своеобразный период индукции. Одновременно 3-фосфоглицериновый альдегид превращается, согласно реакциям ФБФ-пути, в пировиноградную кислоту, которая затем декарбоксилируется в ацетальдегид. Но ацетальдегид не может восстанавливаться в спирт, т.к. НАДН использован для образования глицерина из дигидроксиацетонфосфата. Спиртовое и глицеринпировиноградное брожение тесно связаны. Вначале преобладает глицеринпировиноградное брожение. В присутствии молекулярного кислорода дрожжи быстро переключаются с брожения на аэробное дыхание. При этом пировиноградная кислота, образующаяся из глюкозы, окисляется через цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) Кребса до СО₂ и Н₂О.

Как уже говорилось, в начале спиртового брожения преобладает глицеринпировиноградное брожение, приводящее к образованию глицерина и пировиноградной кислоты. Основная часть пировиноградной кислоты идёт на образование вторичных продуктов. К ним относятся уксусная, молочная, янтарная, пропионовая, муравьиная и некоторые другие кислоты, ацетон, различные альдегиды и сложные эфиры.

Дрожжи, используемые для получения спирта, относятся к роду Saccharomyces. К этому роду отнесено семь видов, размножающихся вегетативно преимущественно в диплоидной фазе. Наибольшее значение имеет вид S. cerevisiae. К этому виду относятся дрожжи, используемые в хлебопечении, спиртовом производстве, пивоварении, производстве кваса. На солодовом сусле в трёхсуточной культуре при 28^оС клетки имеют сферическую, эллипсоидальную или несколько удлинённую формы, располагающиеся единично или парами, иногда клетки образуют короткие цепочки или мелкие грозди.

В зависимости от размера дрожжи разделяются на три морфологические группы:

штаммы, имеющие самые крупные клетки ;

с наименьшими клетками ;

промежуточные .

Некоторые штаммы образуют длинные клетки, достигающие и более.

Огромное значение уделяется штаммам S. cerevisiae. Их подразделяют на расы низового и верхового брожения. К расам низового брожения относятся большинство винных и пивных дрожжей, к расам верхнего брожения – спиртовые, хлебопекарные и некоторые пивные дрожжи. Дрожжи низового брожения функционируют в производстве при температуре и ниже , а верхового – обычно при .В конце брожения низовые дрожжи оседают на дно, формируя плотный осадок, верховые – всплывают на поверхность и образуют «шапку». Способность последних подниматься на поверхность обусловлена тем, что клетки после почкования остаются соединёнными в небольшие цепочки, пузырьки углекислого газа поднимают их на поверхность.

По поведению в бродящей среде дрожжи разделяют на хлопьевидные и пылевидные. В основе этого разделения лежит различие в их флокуляционных свойствах. Хлопьевидные дрожжи оседают на дно либо на поверхность. Пылевидные дрожжи в течение всего процесса брожения находятся во взвешенном состоянии. Флокулируют дрожжи как низового, так и верхового брожения. Применение чистых культур специально селекционированных микроорганизмов – важный этап борьбы за качество и чистоту процесса брожения. Чистые культуры дрожжей размножаются в производственных лабораториях на оптимальных для их роста средах, пересевая во всё возрастающие по объёму ёмкости. В цехах создают условия, необходимые для жизнедеятельности дрожжей в заданном направлении и позволяющие подавить рост вредных микроорганизмов. На заводах в процессе длительного культивирования, особенно при непрерывных способах брожения, в результате спонтанного мутагенеза в дрожжевой популяции могут накапливаться мутанты, более приспособленные к условиям производства по сравнению с исходной расой. Отбор новых рас дрожжей, как правило, проводят из ферментёров, в которых процесс брожения происходит в лабораторных условиях. Расы, дающие наилучшие показатели брожения, становятся производственными и широко применяются в практике. В последние годы при селекции дрожжей для роста ряда отраслей промышленности (производство спирта из мелассы, хлебопечение) с успехом применяют метод гибридизации.

Получение этилового спирта. В эпоху промышленного прогресса спирт широко применяют как растворитель и химическое сырьё для производства синтетического каучука. В настоящее время в нашей стране большая часть этилового спирта используется на технические нужды, остальная часть - в медицинских и для других целей. Этиловый спирт – горючее, которым частично можно заменить бензин, его добавляют к бензину (10% и более). Смесь спирта и бензина (газоголь) используется как топливо для автомобильного транспорта. В процессе спиртового брожения, отмечалось выше, наряду с основным продуктом брожения – этанолом образуются побочные продукты: глицерин, высшие спирты, сивушные масла, альдегиды, органические кислоты, эфиры, углекислый газ. Большинство из них находят практическое использование. Сивушное масло и эфирно-альдегидную фракцию выделяют при ректификации этилового спирта и выпускают в виде технических продуктов. Углекислый газ улавливают, очищают от сопутствующих примесей и превращают в жидкую углекислоту. Её используют в разных целях, в том числе для газирования воды, пива и безалкогольных напитков, она применяется при сварочных работах как защитный агент против окисления швов. Сухой лёд, получаемый из сжиженного углекислого газа, применяют в качестве хладагента в пищевой промышленности, медицине, машиностроении и энергетике. Сырьем для производства спирта служат разнообразные растительные материалы, содержащие в достаточном количестве сбраживаемые сахара и углеводы. Широко используются крахмалсодержащие материалы – зерно (рожь, пшеница, кукуруза, ячмень, овёс, просо) и картофель, дефектная сахарная свекла, древесина, отходы сельскохозяйственных растений.

Процесс производства спирта из крахмалистого сырья включает ряд стадий. В начале сырьё измельчают и разваривают с целью извлечения и растворения крахмала. Т.к. крахмал не подвержен действию ферментов дрожжей, способных сбраживать только дисахариды и моносахариды, охлаждённую разваренную массу обрабатывают амилолитическими ферментами солода и грибов. Осахаренная масса содержит углеводы, глюкозу, декстрины, пептиды, аминокислоты, фосфорорганические соединения, минеральные соли и микроэлементы. Следующая стадия – сбраживание осахаренной массы. Применяют периодический и непрерывный – проточный - методы брожения. Для этого используют естественно-чистые культуры дрожжей. Последние систематически ведут на производственных заторах в специальном дрожжевом отделении. Для подавления в них размножения бактерий пастеризованной и охлаждённой до 30⁰С затор подкисляют серной кислотой до рН = 3,8-4,0. Такие значения рН менее благоприятны для развития дрожжей, чем рН = 4,5-5,0, но медленное размножение дрожжей компенсируется возможностью получения чистой культуры. Спиртовые дрожжи, применяемые при переработке крахмалистого сырья, должны обладать высокой бродильной способностью, быстро и полностью сбраживать сахара, а также использовать другие компоненты питательной среды в анаэробных условиях, быть устойчивыми к продуктам своего обмена. Уже около 70 лет применяют S. cerevisiae. Эти дрожжи хорошо сбраживают глюкозу, фруктозу, сахарозу и мальтозу, на 1/3 - раффинозу, галактозу. В среде накапливают до 10-11% спирта. Оптимальная температура развития от 30 до 38 ⁰С, минимальная температура 5 ⁰С. Значение рН во время брожения поддерживают в пределах 3,8-4,0. После сбраживания заторов остаются неиспользованными около 0,1% галактозы, 0,4% декстринов и 0,5% пентоз. В последние годы большое внимание уделяется селекции термотолерантных рас, обладающих в промышленном производстве ряд преимуществ.

Разрабатываются методы получения этанола на различных субстратах с использованием иммобилизованных клеток микроорганизмов. Меласса – побочный продукт сахарного производства (содержит около 80% сухих веществ и 20% воды). Сухие вещества представлены сахарами, безазотистыми органическими, азотсодержащими и минеральными веществами. Азотсодержащие вещества мелассы представлены в основном продуктами распада белковых веществ – аминокислотами и бетаином. Содержит она витамины группы В и биотин, необходимые для роста дрожжей. Нормальная, доброкачественная меласса имеет слабощелочную или нейтральную реакцию (рН = 7,8-8,9). К дрожжам, используемым для сбраживания мелассных растворов, предъявляются в основном те же требования, что и к расам для производства спирта на крахмалистых средах. Кроме того, они должны обладать способностью, переносить высокие концентрации сухих веществ, содержащихся в мелассе, и, возможно, более полно сбраживать раффинозу. Для селекции рас дрожжей с требуемыми свойствами был применён метод гибридизации. Сырьём для получения технического спирта могут служить гидролизаты древесины и других растительных отходов. Древесина хвойных и лиственных содержит от 40 до 75% полисахаридов. Различают легко- и трудногидролизуемые полисахариды. Растительное сырьё подвергают кислотному гидролизу под давлением. Полученный гидролизат содержит 3,2-3,5% редуцирующих сахаров, преимущественно глюкозу, в небольших количествах галактозу и маннозу, а также пентозы – ксилозу, арабинозу, рамнозу. Брожение проводят по непрерывно поточному методу при высокой концентрации биомассы (17-25 г/л). Присутствующие в гидролизатах вредные примеси играют роль антисептиков – подавляют развитие посторонних микроорганизмов. Поэтому на спиртовых заводах отсутствуют установки для размножения чистых производственных культур дрожжей, а одни и те же дрожжи используют на протяжении многих месяцев. Зрелая бражка, полученная в результате брожения, содержит 1-1,5% этанола и побочные продукты. При перегонке бражки и ректификации гидролизного спирта не удаётся полностью избавиться от этих примесей, гидролизный спирт содержит 0,05-0,1% метанола и несколько большее количество кислот, сложных эфиров и альдегидов, чем ректификат из пищевого сырья. В последние годы выявлены дрожжи Pachusoten tantophilus, Candida shehatae (синоним Pichia spiritus), способные сбраживать также ксилозу, что может обеспечить утилизацию до 90% сахаров, образующихся при гидролизе растительной массы. Сульфитные щелока являются отходами целлюлозного производства, когда целлюлоза извлекается в неповреждённом виде, а гидролизуются только гемицеллюлозы. Лигнин, входящий в состав древесины, образует с сернистой кислотой водорастворимые лигносульфокислоты. Суммарная концентрация сахаров достигает 3-3,5%, из них 62-68% - сбраживаемые. Применяют для сбраживания расы S. cerevisiae, которые хорошо используют галактозу, обладают флокулирующими свойствами и собираются волокнами целлюлозы. Зрелая бражка содержит 0,5-1% этилового спирта и много летучих примесей. Сульфитный спирт является самым дешёвым. Его стоимость примерно в 3 раза ниже пищевого.

Молочнокислое брожение представляет собой анаэробный процесс разложения углеводов ферментами молочнокислых бак­терий с образованием молочной кислоты и других продуктов. В зависимости от вида бактерий, участвующих в этом про­цессе, конечные продукты брожения могут быть разными. Раз­личают гомоферментативное молочнокислое брожение, при котором молочный сахар образует только молочную кислоту. При гетероферментативном брожении, кроме молочной кис­лоты, образуются другие продукты (летучие кислоты, спирты, газы, эфиры). Возбудителями гомоферментативного брожения являются микроорганизмы: Streptococcus lactis — имеют вид овальных кокков диаметром 0,5—1,0 мкм, располагаются в культуре попарно (диплококки) или короткими цепочками (стрепто­кокки), реже - одиночными клетками; Streptococcus crеmoris - клетки расположены более длинными цепочками; Lactobacillus bulgaricus — крупная палочка (длиной 4-5 мкм), неподвиж­ная, грамположительная, располагается в виде отдельных кле­ток и коротких цепочек, оптимальная температура ее развития 40-45°С; Lactobacillus acidophilus— по морфологии близка к болгарской, но имеет другой температурный оптимум развития — 37°С. Используется для изготовления ацидофилина. Микроорганизмы гетероферментативного брожения ча­ще встречаются в заквашенных овощах и силосе. К ним отно­сятся Lactobacillus brevis, Lactobacillus brassicae Leuconostoc mesenteroides и др. В промышленности используются культурные расы бактерий, которые имеют ряд преимуществ перед дикими фор­мами.

Методика выполнения работы

Определение спирта

Материалы и оборудование

Колбы на 250 мл, сахароза, пекарские дрожжи, мерные цилиндры, пробки и изогнутые стеклянные трубки, водяные бани, электрические плитки, баритовая вода, пробирки, спиртовка, H₂SO_4­ (конц.), пробирки с прямыми стеклянными трубками, K₂Cr₂O­₇.

Ход работы

В колбу ёмкостью 250 мл наливают 50 мл 20%-ного водного раствора сахарозы и около 1 г пекарских дрожжей, разведённых в 10 мл 20%-ного раствора сахарозы. (Дрожжи следует развести за час до занятия и поставить в тёплое место, чтобы повысить их активность). Параллельно для получения этилового спирта путём прямой перегонки бражки ставят такой же опыт, но в расчёте на 2 л жидкости. Колбу закрывают пробкой с изогнутой стеклянной трубкой. Нижний конец трубки погружают в пробирку с баритом. Колбу с бродящей жидкостью помещают на водяную баню с температурой 35-40⁰С. Через несколько минут после установки прибора в пробирку с баритом начинают поступать пузырьки газа, через 10-15 минут образуя равномерную цепочку. Можно считать, что к этому времени весь воздух из колбы вытеснен и выходит один из продуктов брожения – углекислый газ. В результате баритовая вода интенсивно мутнеет вследствие образования нерастворимого осадка ВаСО₃. Доказать образование спирта пока невозможно из-за его малого количества. Поэтому колбы с бродящей жидкостью закрывают ватными пробками и оставляют до следующего занятия в комнате. На следующем занятии в жидкости обнаруживается спирт. В пробирку к 1-3 мл исследуемой жидкости добавляют кристаллик K₂Cr₂O­₇, несколько капель H₂SO_4­ и нагревают смесь на спиртовке. Цвет жидкости при этом изменится до зелёного вследствие восстановления хрома из шести до трёхвалентного состояния.

Выделяющийся уксусный альдегид ощутим по запаху.

Обнаружение спирта отгонкой

Колбу с бродильной жидкостью закрывают пробкой, в которую вставлена идущая вверх прямая стеклянная трубка длиной 40-50 см. Колбу нагревают до равномерного кипения жидкости и к концу стеклянной трубки подносят горящую лучину.

Провести отгонку спирта из двухлитрового объёма бражки с прямым холодильником и повторить реакцию с бихроматом калия. Определить процентное содержание спирта в отогнанной фракции спиртометром и рассчитать выход по веществу в расчёте на растворённую сахарозу.

Определение молочной кислоты

Материалы и оборудование

Молочнокислые продукты, огуречный и капустный рассол, микробиологические петли, спиртовки, раствор метиленового синего, пинцеты, микроскопы, пробирки, спиртовки, смесь Никифорова, пробирки со стерильным молоком, чистые культуры молочнокислых бактерий, воронки со складчатыми фильтрами, 10%-ный раствор серной кислоты, 2%-ный раствор перманганата калия, 0,5%-ный раствор нитрата серебра, полоски филь­тровальной бумаги, концентрированная серная кислота, насы­щенный раствор медного купороса, 0,2%-ный спиртовой рас­твор тиофена, водяная баня, электрическая плитка.

Ход работы

Для ознакомления с бактериями молочнокислого брожения можно воспользоваться готовыми молочнокислыми продукта­ми (простокваша, ацидофилин, кефир) и рассолом квашеной капусты и огурцов. Указанные продукты наносят петлей на предметное стекло и делают тонкий мазок. Мазок фиксируют и одновременно обезжиривают смесью Никифорова (10 мин).

Окрашивают в течение 3-5 минут водным раствором метиленового синего, промывают водой, высушивают и микроскопируют с объективом МИ-90.

Для доказательства образования молочной кислоты прово­дят качественную реакцию. Один из молочнокислых продуктов фильтруют через складчатый фильтр. В пробирку к 2 мл филь­трата добавляют 5 мл концентрированной серной кислоты и 10 капель насыщенного раствора медного купороса. Нагрева­ют при встряхивании на водяной бане при 100°С в течение 5 мин. После охлаждения добавляют 3-5 капель 0,2%-ного раствора тиофена в спирту. В присутствии молочной кислоты возникает вишнево-красное окрашивание.

Контрольные вопросы

1. Классификация дрожжей, используемых для спиртового брожения.

2. Химизм спиртового брожения.

3. Характеристика дрожжей, применяемых в промышленности.

4. Получение этилового спирта в промышленности.

5. Типы молочнокислого брожения, их продукты.

6. Возбудители гомоферментативного брожения.

7. Возбудители гетероферментативного брожения.

8. Качественная реакция на образование молочной кислоты.

9. Ход работы.

РАБОТА 5

Подготовка, характеристики посевного материала в

зависимости от вида продуцента и типа исходной культуры

Цель работы

Ознакомиться с технологией получения посевного материала в цехе чистой культуры, провести посев чистой культуры из музея на косяки с сусло-агаром и МПА, а затем - культивирование на жидкой питательной среде на качалочных колбах.

Теоретические основы

Посевным материалом называют чистую культуру микроорганизма-продуцента, «размноженную» до такого количества (объема), которое необ­ходимо для засева промышленных аппаратов. Для получения посевного материала используют исходную культуру продуцента, хранящуюся в центральной заводской лаборатории. Каждая производственная культура имеет паспорт, в котором указаны ее название (род, вид), коллекционный номер, серия и дата выпуска, средний уровень активности, срок годности. В паспорте представлена характеристика среды для выращивания и хранения культуры. Чтобы свойства культуры-продуцента оставались без изменения, ее надо хранить в соответствующих условиях. При длительном хранении, особенно при частых пересевах, легко изменчивыми являются, прежде всего, физиологические признаки культуры, т.е. те, которые представляют наибольший интерес для получения целевого продукта.

Технология получения посевного материала в цехе чистой культуры

Приготовление посевного материала в зависимости от вида продуцента, его физиолого-биохимических особенностей состоит из нескольких после­довательных этапов:

и сходная культура (в пробирке) выращивание на скошенной агари-

з ованной среде (в пробирках) выращивание в колбах на качалке на

ж идкой среде (одна- две стадии) выращивание в посевном аппарате

( инокуляторе - один или несколько) накопление культуры микроор­ганизмов в малом ферментаторе посевной материал

Первая стадия выращивания посевного материала осуществляется в за­водской лаборатории. Исходную культуру размножают на скошенной агаризованной среде в пробирке в стерильных условиях при оптимальных составе питательной среде и режиме выращивания (рН, температура, длительность). Выращенную культуру стерильно смывают водой с поверхности агаризованной среды в колбы Эрленмейера вместимостью 750 мл, содержащие 50-100 мл жидкой питательной среды. Колбы с культурой помещают на качал­ку, которая находится в термостатируемом помещении (28-30°С). Переме­шивание культуры, которая осуществляется встряхиванием качалки (120-240 об/мин), увеличивает скорость роста культуры благодаря интенсификации массообмена. Продолжительность выращивания культуры в колбах на ка­чалке составляет 18-36 часов. Наилучшие результаты дает культура, которая находится в стадии физиологической зрелости в конце логарифмической фа­зы роста. На второй стадии выращивания посевного материала готовую культуру из колб стерильно переносят в посевной аппарат (инокулятор), в который предварительно вносят парафины и минеральные соли в определенных ко­личествах. Посевной аппарат оснащен мешалкой, аэрирующим устройством, а также контрольно-измерительной аппаратурой для регулирования темпе­ратуры, рН, уровня пены и т.д. Объем питательной среды в аппарате не дол­жен превышать 60% от общего объема. Важное значение имеет количество внесенного в аппарат посевного материала. При малом количестве посевного материала требуется более длительный период инокуляции. Поэтому в по­севной аппарат вносят посевного материала 10-12% от объема пита­тельной среды. Обычно процесс заканчивается за 12-14 часов. Третья стадия культивирования посевного материала осуществляется в посевном аппарате объемом 3,2 м³. Для этого все содержимое малого ино-кулята перекачивается в аппарат большего объема, в котором находится простерилизованная питательная среда. Процесс выращивания длится 12-14 часов. Четвертая стадия процесса осуществляется в аппарате объемом 50 м³. Перед приемом дрожжевой суспензии с предыдущей стадии в аппарате гото­вят питательную среду путем подачи парафина, растворов питательных солей и микроэлементов. Среду доводят до оптимальных значений рН и темпера­туры, перекачивают засевные дрожжи с предыдущей стадии и начинают процесс выращивания при непрерывной аэрации и перемешивании. Процесс накопления дрожжей длится 10-12 часов. Когда концентрация абсолютно су­хих дрожжей в среде составит 14-17 г/л, дрожжевую суспензию можно пода­вать в производственные ферментаторы. Полученный посевной материал подвергают тщательному микробиологическому и биохимическому контро­лю, так как от его активности и чистоты зависит дальнейший производст­венный цикл.

Методика выполнения работы

Материалы и оборудование

Термостат, микробиологические петли, качалочные колбы, горелка, качалка, чистая культура микроорганизмов, пробир­ки (косяки) с МПА и сусло-агаром, мясо-пептонный бульон.

Ход работы

Методика посева чистой культуры на косяки с МПА и сусло-агаром

На пробирке со свежей питательной средой разборчиво подписывают на­звание микроорганизма и дату посева. Надписи делают чернилами по стеклу или стеклографом.

Зажигают горелку. Посевы проводят над пламенем горелки, чтобы теп­лый воздух препятствовал осаждению микроорганизмов из окружающего воздуха и отчасти их уничтожал.

Берут в правую руку бактериологическую петлю, с помощью которой осу­ществляют посев (петлю держат как карандаш). Стерилизуют бактериологическую петлю в пламени горелки, прокаливая проволоку докрасна, и одновременно обжигают примыкающую к петле часть держателя, который будет вводиться в пробирку с чистой культурой микро­организмов. При прокаливании петлю держат в пламени почти вертикально, чтобы вся проволока была раскалена. Берут в левую руку две пробирки: одну - со стерильной средой (дальше от себя), другую - с культурой микроорганизмов (ближе к себе). Не выпуская бактериологической петли в правой руке, мизинцем и безы­мянным пальцем правой руки прижимают наружные концы ватных пробок к ладони и вынимают пробки из пробирок. Класть пробки на стол нельзя. Слегка обжигают в пламени горелки края открытых пробирок. Вводят в пробирку с культурой микроорганизмов петлю. Чтобы не повре­дить клетки микроорганизмов, петлю сначала охлаждают, прикасаясь ею к внутренней поверхности пробирки или к питательной среде, свободной от клеток микроорганизмов, и только после этого отбирают небольшое количе­ство микробной массы. Вынимают петлю и вводят ее в пробирку со стерильной питательной сре­дой, избегая прикосновения со стенками пробирки. Проводят петлей вверх от дна пробирки зигзагообразную или прямую черту-штрих, слегка касаясь поверхности агара. Одновременно обжигают ватные пробки и края пробирок в пламени и за­крывают обе пробирки. Обжигают петлю в пламени. Аналогичную операцию провести с другими пробирками с агаризованной средой.

Внесение посевного материала в колбы с жидкой питательной средой

Выращенную культуру стерильно смывают водой с поверхности агари-зованной среды пробирок в качалочные колбы, содержащие 50-100 мл жид­кой питательной среды (мясо-пептонный бульон). Колбы с культурой помещают на качалку с заданной скоростью - 120-240 об/мин. Температура в по­мещении, где происходит культивирование, должна быть около 30^оС. В зави­симости от типа выращиваемой культуры продолжительность процесса мо­жет составлять от 0,5 до 3 суток. Процесс ферментации необходимо контро­лировать по морфологическим показателям микроорганизма.

Контрольные вопросы

1.Что называют «посевным материалом»? Какие стадии различают в

подготовке посевного материала?

2. Какие сведения входят в паспорт культуры-продуцента?

3. Какое количество посевного материала необходимо вносить в

посевной аппарат?

4. Ход работы.

Модуль 2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ И ПОЛУЧЕНИЕ КОНЕЧНЫХ ПРОДУКТОВ

Работа 6,7

Особенности роста микроорганизмов в условиях непрерывного

культивирования. Хемостат, турбидостат, оксистат. Сравнительная характеристика, применение.

Цель работы

Ознакомиться с теорией периодического и непрерывного культивирования микроорганизмов, основными количественными характеристиками процесса, влиянием аэрации на рост бактерий. Исследовать влияние внешних условий на развитие микроорганизмов.

Теоретические основы

Культивирование микроорганизмов в контролируемых и управляемых условиях является основной для оптимизации технологического процесса. Раньше оптимизация для периодического культивирования в основном совершалась методом "проб и ошибок". По мере развития технологии, изучения физиологии и биохимии микроорганизмов методы культивирования совершенствовались и видоизменялись. Многие технологические приемы проведения химических реакций оказались пригодными для микробиологических процессов, прежде всего - проведение их в реакторах-ферментерах со всем необходимым их оснащением. Сначала - лабораторный этап, затем укрупненный масштаб (10-100 л), затем крупномасштабное производство (до 100 м³). Все методы культивирования делятся на периодические и непрерывные.