Визначення вмісту молочної кислоти в крові ензиматичним методом

Практичне значення роботи: Визначення кількості молочної кислоти в крові дає можливість оцінити ступень тренованості організму спортсмена.

Принцип методу: молочна кислота в присутності ферменту лактатдегідрогенази (ЛДГ) і НАД перетворюється в піровиноградну кислоту

L-лактат + НАД ↔ піруват + НАД Н₂.

По кількості утвореного НАД Н₂, який визначають спектрофотометрично, роблять висновок про вміст молочної кислоти, оскільки реакція проходить стехіометрично – 1 моль НАД на 1 моль молочної кислоти дає 1 моль НАД Н₂.

Матеріали і реактиви: Термостат, центрифуга, піпетки, пробірки, 0,5 моль/л гліцин-гідразинового буферу (рН 9,0), 0,027 моль/л розчин НАД, розчин лактатдегідрогенази (ЛДГ) – 2 мг/мл, 0,6 моль/л розчин НСlО₄.

Хід роботи: 0,5 мл венозної крові, яка узята без джгута, вносять до центрифужної пробірки, яка містить 1 мл охолодженого до 0°С розчину НСlО₄. Через 5 хв суміш центрифугують при 3000 об/хв. впродовж 10 хв. Потім 0,1 мл безбілкового центрифугату змішують з 1 мл гліцин-гідразинового буферу, 0,02 мл розчину ЛДГ і 0,1 мл розчину НАД. Проводять інкубацію протягом 1 години при 25°С. Оптична щільність вимірюється за допомогою спектрофотометру в кюветі з товщиною шару 10 мм (довжина хвилі 340 нм). Компенсаційною рідиною є бідистильована вода.

Для кожної серії визначень ставлять контрольну пробу, в якій досліджувану рідину (0,1 мл центрифугату) замішують з 0,1 мл розчину розбавленого НСlО₄ (1 об'єм 0,6 моль/л НСlО₄ і 1 об'єм бідистильованої води).

Різниця оптичної щільності між дослідною (Еоп.) і контрольною (Ек.) пробами дає ΔЕ. Кількість молочної кислоти в крові встановлюють за формулою:

Норма – 1,035±0,072 ммоль лактату/л крові.

Клініко-діагностичне значення

Інтенсивні і тривалі м'язові навантаження, патологічні стани (епілепсія, тетанія і судомні стани) призводять до стрімкого зростання концентрації молочної кислоти. Зростання рівня молочної кислоти спостерігається також при важких ураженнях печінки і гіпоксіях.

При роботі в анаеробних умовах рівень лактату може досягати 6,0-10,0 ммоль/л залежно від ступеня розвитку кисневого боргу. При роботі, пов'язаній з проявом витривалості, рівень лактату рідко перевищує 2,0-3,0 ммоль/л.

Швидкість зниження рівня лактату у періоді відновлення є критерієм ефективності відновних процесів.

Зробити висновки.

Контрольні питання:

1. Вкажіть основні субстрати і метаболіти анаеробного ресинтезу АТФ.

2. Які процеси вимагають витрат енергії АТФ м'язовою клітиною при роботі?

3. Охарактеризуйте взаємозв'язок фізичного навантаження і шляхів ресинтезу АТФ.

4. Порівняйте енергетичні можливості креатинкіназного і міокіназного шляхів ресинтезу АТФ.

5. Дайте характеристику гліколізу. Розкрийте механізм його розвитку. Вкажіть основні субстрати і метаболіти.

6. Які Ви знаєте лімітуючі фактори анаеробного ресинтезу АТФ?

7. Яке значення має визначення вмісту молочної кислоти в крові ензиматичним методом в спортивній практиці.

Література:

1. Бернштейн Н.А. Очерки по физиологии движений и физиологии активности. – М.: Физкультура и спорт, 1966. – 135 с.

2. Волков Н.И., Несен Е.Н., Осипенко А.А., Корсун С.Н. Биохимия мышечной деятельности. – Киев: Олимпийская литература, 2000.

3. Иванов К.П. Основы энергетики организма. — Л.: Наука_: 1990. — 307 с.

4. Мелихова М.А. Динамика биохимических процессов в организме человека при мышечной деятельности: Учеб. пособие/ ГЦОЛИФК. – М., 1992.

5. Таймазов В.А., Марьянович А.Т. Биоэнергетика спорта. – СПб.: Шатон, 2002.

6. Яковлев Н.Н. Химия движения: Молекулярные основы мышечной деятельности. — Л.: Наука, 1983.— 192с.