Практична частина Якісні реакції на білки цитоплазми м'язових клітин. Біуретова реакція

Практичне значення роботи: речовини, які входять до складу саркоплазми м'язової клітини, після її руйнування можна відокремити від структурних білків центрифугуванням і виявити їх якісними реакціями, а також визначити їх кількість. До якісних (кольорових) реакцій на білки відносяться:

а) біуретова реакція (на пептидний зв'язок білків) – дія на білок розчину лугу і розчину сульфату міді (ІІ), при цьому розчин набуває фіолетового забарвлення;

б) ксантопротеїнова реакція (для білків, які містять бензольні кільця) – дія концентрованої азотної кислоти з появою жовтого забарвлення. При додаванні лугу жовте забарвлення змінюється на оранжеве;

в) цистеїнова реакція (для білків, які містять сірку) - кип'ятіння розчину білка з ацетатом свинцю (ІІ) з появою чорного забарвлення;

г) реакція Міллона (для білків, які містять фрагменти фенолу) - кип'ятіння розчину білка з реактивом Міллону [розчином, який містить Hg(NО₃)₂ і НNО₂] з появою червоного забарвлення;

д) реакція з нітропруссидом натрію (для білків, які містять групи – SН), з яким білки дають червоне забарвлення в аміачному середовищі.

Принцип методу: білки реагують в лужному середовищі з сульфатом міді з утворенням сполук, забарвлених в фіолетовий колір (біуретова реакція)

Матеріали і реактиви:

1. М'яз тварини, дистильована вода, хлорид амонію, 5% р-н калію хлориду, натрію гідроксид, сульфат міді (ІІ), 10% р-н сульфосаліцилової кислоти, фільтрувальний папір, марля, пісок, ступка, воронка, пробірки.

2. 0,9% розчин натрію хлориду; 0,2н розчин натрію гідроксиду, вільний від вуглекислого газу; біуретовий реактив; 0,5% розчин калію йодиду в 0,2н розчині натрію гідроксиду; робочий розчин біуретового реактиву (20 мл біуретового реактиву змішують з 80 мл розчину калію йодиду); стандартний розчин альбуміну (10% розчин альбуміну в 0,9% розчині натрію хлориду, 1 мл розчину містить 0,1 г білка).

Хід роботи:

1. Підготування матеріалу для дослідження: У фарфорову ступку поміщають 10 г м'язів, які вирізані у тільки-но забитої тварини, розтирають зі скляним піском, переносять в стаканчик, заливають 30 мл води і відстоюють 15 хвилин, періодично перемішуючи скляною паличкою. Фільтрують через 3 шари марлі. Залишок тканини в стаканчику знову заливають 30 мл води, відстоюють при помішуванні 15 хвилин і фільтрують. Колбу з об'єднаним водним екстрактом тимчасово відставляють, а мускульну масу, яка залишилася в стакані, переносять у фарфорову ступку і заливають 30 мл 8 % розчину NH₄Cl або 5 % розчину КСl, залишають на 30-60 хвилин, час від часу перемішуючи товкачем. Потім рідину фільтрують через паперовий фільтр в чисту суху колбу.

2. Визначення білків саркоплазми: у 2 пробірки наливають по 2 мл водного екстракту, в першій проводять біуретову реакцію, а в другій – денатурацію білків.

І пробірка. Білки реагують в лужному середовищі з сульфатом міді з утворенням сполук, забарвлених у фіолетовий колір (біуретова реакція).

Біуретова реакція: до 0,1 мл сироватки додають 5,0 мл робочого розчину біуретового реактиву, змішують, уникаючи утворення піни. Через 30 хвилин (і не пізніше, ніж через 1 годину) вимірюють екстинкцію розчину на фотоелектроколориметрі в кюветі з товщиною шару 10 мм при довжині хвилі 540—560 нм (зелений світлофільтр) проти контрольного розчину. Для приготування контрольного розчину до 5,0 мл робочого розчину біуретового реактиву додають 0,1 мл 0,9% розчину натрію хлориду; далі обробляють, як експеримент.

Розрахунок кількості білка в розчині ведуть за допомогою калібрувального графіку.

Побудова калібрувального графіка. Із стандартного розчину готують робочі стандартні розчини, як вказано в табл. 2:

Таблиця 2.

Розчини з різною концентрацією білка

№ п/п	Стандартний розчин білка, мл	0,9%-вий розчин хлористого натрію, мл	Концентрація білку в г/л
І	0,4	0,6	40
ІІ	0,6	0,4	60
ІІІ	0,8	0,2	80
ІV	1,0	-	100

З кожного розведення беруть по 0,1 мл робочого розчину і додають по 5,0 мл робочого біуретового реактиву; через 30—60 хвилин вимірюють на фотоелектроколориметрі, як в експерименті, проти контролю. За отриманими даними будують калібрувальний графік.

Нормальні величини: 65—85 г/л.

Клініко-діагностичне значення

Білки плазми беруть участь:

- в регуляції колоїдно-осмотичного тиску крові, забезпечують її в'язкість;

- в утворенні буферних систем крові;

- в зв'язуванні надлишку гормонів, нейтралізуючи їхню дію;

- в транспорті речовин;

- в роботі імунної системи;

- в процесах згортанні крові.

При недостатньому надходженні білків з їжею білки плазми крові можуть використовуватися як джерело амінокислот для синтезу життєвоважливих білків організму. Це призводить до зниження загальної кількості білків плазми крові.

У патологічних змінах вмісту загального білка сироватки крові можуть зустрічатися: гіпопротеїнемія — зниження концентрації загального білка; гіперпротеїнемія — підвищення концентрації загального білка. Гіпопротеїнемія спостерігається при нефротичному синдромі, ентериті, хронічному панкреатиті, екземі, масивних крововтратах, при затримці води в результаті серцевої декомпенсації, при великих втратах білка з сечею при нефриті, при тривалих запальних захворюваннях. Гіперпротеїнемія зустрічається рідше, наприклад, при хронічних запальних захворюваннях, які супроводжуються дегідратацією організму (пронос, блювота).

ІІ пробірка. У другій пробірці проводять осадження білків: у досліджувану рідину додають 5-6 крапель 10% розчину сульфасаліцилової кислоти і спостерігають утворення осаду білка, тобто реакцію денатурації білка.

Зробити висновки.

Контрольні питання:

1. Наведіть основні види біохімічних методів досліджень, які використовуються для визначення функціонального стану спортсменів.

2. Фотометрія. Абсорбційна фотометрія. Вкажіть принцип методу і опишіть методику його використання.

3. Що лежить в основі методу емісійної фотометрії? Дайте характеристику флюориметрії, полум'яної фотометрії.

4. Вкажіть правила проведення фотометрії і розрахунку результатів досліджень.

5. Дайте характеристику методу рН-метрії.

6. Опишіть автоматичні аналізатори рН і газів крові.

7. Наведіть способи підготування матеріалу для дослідження при проведенні якісних реакцій на білки цитоплазми м'язових клітин

8. Які умови проведення біуретової реакції?

9. Вкажіть клініко-діагностичне значення визначення концентрації білків плазми крові.

Література:

1. Горячковський О.М. Клінічна біохімія: Довідковий посібник/ Вид. 2-е, вип. і доп. – Одеса: Астропринт, 1998. – 608 с.

2. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3 т.: Пер. с англ. — М.: Мир, 1985.

3. Рогозкин В.А. Биохимическая диагностика в спорте. — Л.: Наука, 1988. — 50 с.

4. ГОСТ 27025-86 “Реактивы. Общие указания по проведению испытаний”

5. ДСТУ 3651.0-97 “Метрологія. Основні одиниці фізичних величин міжнародної системи одиниць. Основні положення, назви та позначення.

6. ГОСТ 29227 – 91 “Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки (ИСО 835/1 - 81) градуированные. Общие требования”