Практична частина
Завдання №1. Оптимізований мікрометод визначення активності аланінамінотрансферази (АлАТ) в сироватці крові (оптичний тест).
Практичне значення роботи: АлАТ забезпечує переамінування в реакціях за участю аланіну, альфа-кетоглутарової, глутамінової та піровиноградної кислот. Процеси переамінування мають місце у всіх тканинах і органах, але найбільш інтенсивно в серці, печінці, скелетному м'язі, нирках і тромбоцитах у спортсменів у відновлювальний період.
Принцип методу: АлАТ каталізує обернене перенесення аміногруп L-аланіна на α-кетоглутарову кислоту.
А. Основна реакція:
Б. Індикаторна реакція:
Активність ферменту визначається на основі відмінності спектрів поглинання відновленої і окисненої форми НАДН при довжині хвилі 340 нм. Рівновага реакції зрушена вправо (у бік утворення NAД).
Матеріали і реактиви: фосфатний буфер 0,1 моль/л, рН 7,4; субстратно-буферний розчин; розчин НАДН, 15 ммоль/л; розчин ЛДГ, активність 48 О/л; 5,0 моль/л розчин натрію гідроксиду; розчин α-кетоглутарату 0,56 моль/л (стартовий реактив); 154 ммоль/л розчин хлориду натрію (0,9%).
Робочий розчин готують перед використанням.
Хід роботи:
Хід роботи наведений в табл. 13.
Таблиця 13.
Хід підготування дослідної та холостої проби при визначенні активності аланінамінотрансферази (АлАТ) в сироватці крові (оптичний тест).
Інгредієнти |
Дослідна проба, мл |
Холоста проба, мл (по повітрю) |
Сироватка Суміш реактивів |
0,55 3,5 |
- - |
Перемішати, інкубувати 10-15 хвилин при 30° або 37°С |
||
α-кетоглутарова кислота |
0,1 |
- |
Негайно перемішують і включають секундомір. Через 60 с (лаг-фаза) вимірюють оптичну щільність реакційної суміші проти повітря при λ = 340 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм. Потім, точно через 1, 2, 3 хв. вимірюють оптичну щільність. Можна як холосту пробу використовувати контроль на реактиви. В цьому випадку в реакційну суміш замість сироватки додають такий же об'єм фізіологічного розчину.
Розрахунок
активності ферменту. З
4-х вимірювань оптичної щільності для
дослідної проби розраховують зміну її
за 1 хв (ΔЕ/Δt)досл
і
(ΔЕ/Δt)хол,
віднімаючи з кожного подальшого значення
оптичної щільності попереднє (результати
виходять із знаком мінус).
З
трьох значень зміни оптичної щільності
для кожної дослідної проби розраховують
середню арифметичну
і
Корегують величину Е дослідної проби:
.
Розрахунок активності АЛАТ проводять за формулою:
,
де V – об'єм реакційної суміші, мл;
ν – об'єм сироватки, мл;
ε – коефіцієнт молярної екстинкції НАДН;
l – товщина шару рідини в кюветі в метрах (1·10-2);
t – час реакції, с;
ΔЕ/Δt – зміна оптичної щільності за 1 с.
Діапазон вимірювання: до 250 О/л.
Нормальні величині: до 25 О/л (0,42 мккат/л) при 30°С; до 39 О/л (0 65 мккат/л) при 37 °С. У кожній лабораторії рекомендується встановлювати свої нормальні величини. Лінійність реакції до 240 О/л. Якщо активність ферменту в сироватці вище 240 О/л, то сироватку слід розвести фізіологічним розчином.
Завдання №2. Оптимізований мікрометод визначення активності аспартатамінотрансферази (АсАТ) в сироватці крові (оптичний тест).
Практичне значення роботи: аспартатамінотрансфераза – клітинний фермент, який бере участь в обміні амінокислот. АсАТ міститься в тканинах сердця, печінки, нирок, нервової тканини, скелетної мускулатури і інших органів. Завдяки високому вмісту в тканинах цих органів, аналіз крові АсАТ - необхідний метод діагностики захворювань міокарда, печінки і різних порушень мускулатури.
AсАT каталізує обернений перенос аміногрупи з аспарагінової кислоти на альфа-кетоглутарову, при цьому утворюються глутамінова і щавлевооцтова кислоти. Остання бере безпосередню участь в циклі Кребса.
Принцип методу: АсАТ каталізує обернене перенесення аміногруп з L-аспарагінової кислоти на α-кетоглутарову.
А. Основна реакція.
Б.
Індикаторна реакція.
Активність ферменту визначається на основі відмінності спектрів поглинання відновленої і окисненої форми НAД при довжині хвилі 340 нм. Рівновага реакції зрушена управо (у бік утворення НAД).
Матеріали і реактиви: фосфатний буфер 0,1 моль/л, рН 7,4; субстратно-буферний розчин; розчин NADH 15 ммоль/л; малатдегідрогеназа (МДГ) з серця свині (L-малат: NAD+ оксидоредуктаза; К.Ф.1.1.1.37); лактатдегідрогеназа зі скелетного м'яза кролика або свині; розчин α-кетоглутарової кислоти (α-КГ) 0,45 моль/л (стартовий реактив); розчин хлориду натрію, 154 ммоль/л (0,9%).
Суміш реактивів готують перед використанням.
Хід роботи:
Хід роботи наведений в табл. 14.
Таблиця 14.
Хід підготування дослідної та холостої проби при визначенні активності аспартатамінотрансферази (АсАТ) в сироватці крові (оптичний тест)
Інгредієнти |
Дослідна проба, мл |
Холоста проба (повітря), мл |
Сироватка Суміш реактивів |
0,55 3,5 |
- - |
Перемішати, інкубувати 10-15 хвилин при 30° або 37°С |
||
α-кетоглутарова кислота |
0,15 |
- - |
Негайно перемішують і включають секундомір. Через 60 с (лаг-фаза, або фаза затримки реакції) вимірюють оптичну щільність реакційної суміші проти холостої проби або повітря при довжині хвилі 340 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм. Потім точно через 1, 2, 3 хв вимірюють оптичну щільність дослідної проби.
Якщо ставлять холосту пробу на реактиви, то в холосту пробу замість сироватки додають такий же об'єм розчину хлориду натрію.
Розрахунок активності фермента. З 4-х вимірювань оптичної щільності для дослідної і холостої проб розраховують зміни її за 1 хв (ΔЕ/Δt)досл і (ΔЕ/Δt)хол, віднімаючи з кожного подальшого значення оптичної щільності попереднє (результати отримують із знаком "мінус"). З трьох значень зміни оптичної щільності для кожної дослідної і холостої проби розраховують середню арифметичну і . Корегують величину оптичної щільності дослідної проби:
Розрахунок активності АсАТ проводять за формулою:
,
де V – об'єм реакційної суміші, мл;
ν – об'єм сироватки, мл;
ε – коефіцієнт молярної екстинкції НАДН;
l – товщина шару рідини в кюветі в метрах (1·10-2);
t – час реакції, с;
ΔЕ/Δt – зміна оптичної щільності за 1 с.
Діапазон вимірювання. До 250 О/л.
Нормальні величини. До 35 О/л при 37°С; до 25 О/л при 30°С.
Відтворюваність. Коефіцієнт варіації 5%, допустима похибка визначення 20%.
Клініко-діагностичне значення
Активність AсАT при прогресивній м'язовій дистрофії і дерматоміозитах досягають 8-кратного перевищення верхньої межі референсних значень (під час інших видів м'язових захворювань, особливо з нейрогенним джерелом активність ферментів звичайно знаходиться в межах норми). Легенева емболія може призводити до підвищення рівня AсАT в 2-3 рази. Помірне збільшення активності (в 2-5 рази від верхньої межі норми) спостерігається під час гострих панкреатитів, ушкоджень м'язів при забиттях, а також при гангрені і гемолітичних захворюваннях (активність AсАT в еритроцитах приблизно в 15 разів вище, ніж в сироватці крові, тому гемоліз еритроцитів викликає підвищення активності AсАT). Слід відмітити, що інтенсивні м'язові вправи з максимальним навантаженням також можуть викликати швидкоминуще збільшення активності AсАT в сироватці крові. Існують певні статеві відмінності у рівні активності AсАT, активність фермента в сироватці крові у жінок дещо нижча, ніж у чоловіків.
Зробити висновки.
Контрольні питання:
1. Які фактори лімітують працездатність в аеробних умовах?
2. Які фактори лімітують працездатність в анаеробних умовах?
3. Які критерії визначають алактатну фізичну працездатність?
4. Які біохімічні фактори сприяють підвищенню працездатності?
5. Розкрийте поняття «Спортивна працездатність».
6. Яке значення має реакція переамінування при великих фізичних навантаженнях у спортсменів?
Література:
1. Волков Н.И., Несен Э.Н., Осипенко А.А., Корсун С.Н. Биохимия мышечной деятельности. – Киев: Олимпийская литература, 2000.
2. Зотов В.П. Восстановление работоспособности в спорте. — Киев: Здоров'я, 1990. — 197 с.
3. Иванов К.П. Основы энергетики организма. — Л.: Наука: 1990. — 307 с.
4. Таймазов В.А., Марьянович А.Т. Биоэнергетика спорта. – СПб.: Шатон, 2002.