Практична частина

Завдання №1. Визначення активності ацетилхолінестерази (К.Ф.3.1.1.8) в сироватці крові колориметричним методом за гідролізом ацетилхолінхлориду

Практичне значення роботи: ацетилхолінестераза каталізує реакцію гідролізу ацетилхоліну, яка відіграє важливу роль в нейрогуморальній передачі. Дія ацетилхоліну пов'язана із зміною проникності нервових і м'язових волокон для іонів натрію таким чином, що електричні потенціали, які виникають при цьому, забезпечують передачу нервових імпульсів. Після гідролізу ацетилхоліну відновлюється електронейтральність, що дає змогу нервовому або м'язовому волокну сприймати наступний імпульс. У відсутності ацетилхолінестерази мембрани залишаються поляризованими і проведення імпульсів блокується.

Принцип методу: під дією холінестерази відбувається гідроліз ацетилхолінхлориду з утворенням оцтової кислоти і холіну. Оцтова кислота змінює рН розчину, що встановлюється за допомогою індикатора.

Матеріали і реактиви: 0,9 М розчин ацетилхолінхлориду; 0,0075 М вероналовий буфер, рН = 8,4; індікатор— феноловий червоний (область дії 6,8— 8,4 рН, зміна забарвлення від жовтого до червоного); 0,1 н розчин соляної кислоти; 0,7% розчин прозерину; 0,1 н стандартний розчин оцтової кислоти.

Хід роботи:

Хід роботи наведений в табл. 11.

Таблиця 11.

Хід підготування дослідної та холостої проби при визначенні активності холінестерази в сироватці крові колориметричним методом за гідролізом ацетилхолінхлориду

Інгредієнти	Дослідна проба, мл	Холоста проба, мл
Сироватка крові Вероналовий буфер Вода	0,1 5,0 0,2	5,0 0,2
Перемішати. Прогріти 5 хв при 37°С
Розчин ацетилхолінхлориду	0,2	0,2
Перемішати. Інкубувати 30 хв при 37°С
Розчин прозерину Сироватка крові	0,2	0,2 0,1

Перемішати. Проби охолоджують і колориметрують при довжині хвилі 500—560 нм (зелений світлофільтр) в кюветах з товщиною шару 5 мм проти води. Забарвлення стійке протягом однієї години. З екстинкції холостої проби віднімають екстинкцію дослідної проби.

Розрахунок ведуть за калібрувальним графіком. Активність холін естерази виражають в мкмолях оцтової кислоти, яка утворилася при інкубації 1 л сироватки протягом 1 хвилини при 37 °С (О/л), або протягом 1 секунди (мккат/л).

Побудова калібрувального графіка. З 0,1 н розчину оцтової кислоти готують розведення, як вказано в таблиці 12:

Таблиця 12.

Методика приготування розведень оцтової кислоти

№ п/п	0,1н розчин оцтової кислоти (мл)	Дистильована вода (мл)	Вміст оцтової кислоти в стандарт-ній пробі	Активність
				О/л	мккат/л
1.	2,0	8,0	4	1333	22,2
2.	4,0	6,0	8	2666	44,4
3.	6,0	4,0	12	4000	66,6
4.	8,0	2,0	16	5333	88,8
5.	9,0	1,0	18	6000	100,0

З кожного розведеного розчину беруть по 0,2 мл, змішують з 5,0 мл вероналового буфера, 0,1 мл сироватки, прогрівають 5 хв. при 37 °С, потім додають 0,2 мл прозерину, 0,2 мл ацетилхолінхлориду, інкубують 30 хвилин при 37 °С і охолоджують. Вимірювання проводять за тих же умов, що і для дослідних проб.

Холосту пробу ставлять як стандартну, але, замість розчинів оцтової кислоти додають дистильовану воду.

Підрахунок активності холінестерази в мікромолях оцтової кислоти на 1 л сироватки за 1 хвилину інкубації при 37 °С (О/л) проводять за формулою:

де С — мікромолі оцтової кислоти в стандартній пробі;

10·10³ — коефіцієнт перерахунку на 1 л сироватки;

30 — коефіцієнт перерахунку на 1 хвилину інкубації.

Прямолінійна залежність калібрувального графіка зберігається в межах від 0 до 6600 О/л.

Нормальні величини: 2666 – 5666 О/л (44,4 – 94,4 мккат/л).

Відтворюваність. Коефіцієнт варіації 7%, допустима похибка визначення 20%.

Примітки:

1. Сироватка повинна бути вільною не гемолізованою.

2. Лимоннокислу і щавлевокислу плазму вживати не можна, оскільки солі лимонної і щавлевої кислот інгібують активність ферменту.

3. Холінестерази проявляють високу активність при взаємодії з холіновими ефірами. У тканинах людини і тварин зустрічається дві холінестерази, які розрізняються між собою:

а) ацетилхолінестераза ("дійсна" холінестераза) — в еритроцитах і нервовій тканині;

б) холінестераза ("неспецифічна" або псевдохолінестераза), яка широко поширена в багатьох тканинах і в плазмі крові.

Ацетилхолінестераза локалізується в основному в мембранах клітин, а холінестераза — в цитоплазмі. Обидві холінестерази не є високоспецифічними за відношенням до субстрату (можуть піддавати гідролізу ряд нехолінових ефірів), інгібуються езерином. Ацетилхолінестераза інгібується також надлишком природного субстрату — ацетилхоліном, а холінестераза цим субстратом не інгібується.

Завдання №2. Визначення активності холінестерази в сироватці крові експрес-методом із застосуванням індикаторного паперу (метод Херцфельд і Штумпфа)

Практичне значення роботи: див. завдання №1.

Принцип методу: холінестеразний індикаторний папір в кислому середовищі забарвлений в жовтий колір, а при нейтральному рН — в синій колір. При контакті з сироваткою крові (рН сироватки 7,4) індикаторний папір синіє. Потім оцтова кислота, яка утворилася під дією сироваткової холінестерази змінює колір від синього через зелений до жовтого. Час, який пройшов від моменту капання сироватки до появи жовтого кольору, використовують як міру для активності холінестерази.

Матеріали і реактиви: холінестеразний індикаторний папір промислового виробництва.

Хід роботи: На середину чистого предметного скла наносять 0,05 мл досліджуваної сироватки. Пінцетом на краплю сироватки поміщають шматочок індикаторного паперу розміром близько 2 см². Папір забарвлюється в синій колір. Негайно ж запускають секундомір. Пробу покривають другим предметним склом і стежать за моментом появи жовтого забарвлення, порівнюючи забарвлення з відповідним жовтим паперовим стандартом (сухим індикаторним папером). Визначають час від моменту нанесення краплі сироватки до появи жовтого кольору в хвилинах.

Нормальні величини. Холінестераза сироватки здорових людей викликає вказані зміни забарвлення індикаторного паперу в проміжку часу від 7 до 21 хвилини. Час менше 6 хвилин відповідає підвищеній активності і час, більше 21 хвилини, свідчить про зниження активності ферменту.

Клініко-діагностичне значення

Холінестераза синтезується в печінці. Особливо багаті на цей фермент нервова і м'язова тканини. Холінестераза бере участь в транспорті іонів через мембрани клітин крові і скелетних м'язів, а також в регуляції збудливості і скоротливості гладенької мускулатури і міокарда. Зниження активності холінестерази в сироватці крові спостерігається під час прийому анаболічних стероїдів і клюкокортикоїдів та супроводжується, як правило, зниженням концентрації альбуміна і збільшенням активності трансаміназ. Відновлення активності фермента свідчить про нормализацію функції печінки.

Зробити висновки:

Контрольні питання:

1. Які біохімічні зміни відбуваються в організмі на різних етапах відновлення?

2. Назвіть умови розвитку фази надвідновлення. Сформулюйте правило Енгельгардта.

3. Назвіть шляхи усунення надлишку лактату у відновному періоді.

4. Вкажіть фази відновлення і дайте їх біохімічну характеристику.

5. Яке клініко-діагностичне значення має визначення активності холінестерази в сироватці крові в спортивній практиці?

Література:

1. Агаджанян Н.А. Адаптация и резервы организма. – М.: ФиС, 1983. – 176 с.

2. Биохимия: Учебник для институтов физической культуры/ Под ред. В.В. Меньшикова, Н.И. Волкова. — М.: Физкультура и спорт, 1986. — 384 с.

3. Зотов В.П. Восстановление работоспособности в спорте. — Киев: Здоров'я, 1990. — 197 с.

4. Мелихова М.А. Динамика биохимических процессов в организме человека при мышечной деятельности: Учеб. пособие/ ГЦОЛИФК. – М., 1992.

5. Платонов В.Н. Общая теория подготовки спортсменов в олимпийском спорте. – К.: Олимпийская литература, 1997. – 584 с.

6. Уилмор Дж.Х., Костилл Д.Л. Физиология спорта и двигательной активности: Пер. с англ. — Киев: Олимпийская литература, 1997. — 503 с.

ЛАБОРАТОРНЕ ЗАНЯТТЯ № 12

Біохімічні зміни в організмі, які відбуваються при виконанні вправ різної потужності і тривалості в різних видах спорту. Оптимізовані мікрометоди визначення активності аланінамінотрансферази і аспартатамінотрансферази в сироватці крові

Мета роботи: Узагальнити знання про біохімічні процеси, які протікають в організмі при виконанні фізичного навантаження різної потужності і тривалості. Опанувати мікрометоди визначення активності аланін амінотрансферази і аспартатамінотрансферази в сироватці крові.

Питання для самопідготовки:

1. Які субстрати забезпечують енергією роботу різної потужності?

2. Назвіть послідовність включення енергозабезпечуючих систем організму.

3. Дайте класифікацію фізичних вправ за зонами потужності.

4. Як досягається поріг анаеробного окиснення у спортсменів з різним ступенем тренованості?

ТЕОРЕТИЧНА ЧАСТИНА

Ступінь біохімічних змін залежить від фізичного навантаження різної потужності і тривалості, тому що в залежності від цього запускаються різні механізми ресинтезу АТФ: анаеробний або аеробний. Використання різних субстратів потребує активації різних систем організму, таких як: серцево-судинна, дихальна, буферна і інші. Наглядніше за все взаємозв’язок двох механізмів енергозабезпечення можна розглянути, аналізуючи затрати енергії при здійсненні бігу на різні дистанції.

Абсолютно анаеробною є дистанція в 100 м. Ресинтез АТФ йде за рахунок кретинфосфата і гліколізу. Час, за який проходять дистанцію, не дозволяє використовувати аеробні джерела енергії.

І навіть на 200-метровій дистанції внесок аеробного механізму складає всього декілька відсотків (рис. 18).

Рис. 18. Вклад різних механізмів енергоутво-рення в затрати енергії при здійсненні бігу на 100 і 200 м

Зміна концентрації основних субстратів і метаболітів анаеробного механізму представлена в таблиці 12.

Таблиця 12.

Основні субстрати і метаболіти анаеробного ресинтезу АТФ.

Показники в м'язі	В стані спокою	Після 6-10 с фізичної роботи	Після 30 с фізичної роботи	В стані знемоги
АТФ	5	5	3	3
КРФ	17	12	5	1
Глікоген	85	74	68	50
Лактат	2	7	22	32
рН	7,0	6,9	6,7	6,3

Енерговитрати на дистанції 400 м на 75% забезпечуються за рахунок анаеробного механізму, з якого на долю креатинфосфатного ресинтезу АТФ доводиться близько 10% на старті і фініші (рис. 19).

Рис. 19. Вклад різних механізмів енергоутворення в затрати енергії при здійсненні бігу на 400 м

Лімітуючим фактором на дистанції 400 м є обмежені можливості креатин-фосфокіназного механізму і накопичення молочної кислоти за рахунок гліколізу. Перспективним напрямом в тренуванні є збільшення частки аеробного ресинтезу АТФ.

Дистанції 800 м і 1500 м відрізняються незначною різницею в співвідношенні гліколізу і аеробного ресинтезу АТФ (рис. 20). Лімітуючим фактором є кількість глікогену, якого може вистачити при анаеробному використанні приблизно на 1000 м. Отже, раніший перехід на аеробний обмін має велике значення на цих дистанціях.

Рис. 20. Вклад різних механізмів енергоутворення в затрати енергії при здійсненні бігу на середні дистанції

На 10 км дистанції основне навантаження за енергозабезпеченням організму несе аеробний механізм ресинтезу АТФ, тому серцево-судинна і дихальна системи, які забезпечують постачання О₂, визначають можливості спортсмена.

На марафонській дистанції витрати енергії поповнюються виключно за рахунок аеробного механізму, але, на відміну від коротших дистанцій, вуглеводного запасу недостатньо, і організм починає використовувати жири, які у тренованої людини забезпечують до 50%, а у нетренованої – до 80% необхідної енергії. Отже, кількість необхідного кисню значно зростає в порівнянні з використанням вуглеводних субстратів енергоутворення.

У міокарді в будь-яких умовах основним є аеробний енергетичний обмін, але в стані спокою основними субстратами є глюкоза, кетонові тіла і жирні кислоти. При інтенсивній фізичній роботі зростає концентрація молочної кислоти, і саме вона стає головним енергетичним субстратом. Фермент лактатдегідрогеназа (ЛДГ) в серцевому м'язі переводить молочну кислоту в піровиноградну, яка і використовується в циклі трикарбонових кислот. Таким чином, при будь-якій інтенсивності роботи серцевий м'яз не відчуває дефіциту в енергетичних субстратах.

У головному мозку при збільшенні фізичного навантаження збільшується споживання глюкози і кисню, різко збільшується споживання фосфоліпідів і амінокислот. Їх дезамінування призводить до зростання концентрації аміаку, який, у свою чергу, є одним з факторів стомлення.

У печінці з початком фізичної роботи посилюється розпад глікогену, а при тривалій роботі з жирів синтезуються кетонові тіла.

У крові особливо помітне зростання концентрації молочної кислоти (у нормі 0,1-0,2 г/л): при роботі із запитом О₂ 50% МСК концентрація зростає до 0,5 г/л, при 85% МСК – 1,5 г/л, а більше 85% - може збільшуватися до 2,5 г/л і вище.

За об'ємом задіяних м'язів фізичні вправи розподіляють на:

- локальну роботу, при якій задіяно менше 50 % м'язів тіла (стрільба з пістолета або гвинтівки, шахи, шашки) – біохімічні зрушення незначні;

- регіональну роботу – задіяно 50% м'язів (теніс, в ігрових видах спорту, наприклад, удар по м'ячу стоячи, велосипед, веслування каное і байдарка) – великі біохімічні зрушення, особливо субстратів і метаболітів енергетичного обміну;

- глобальну роботу – беруть участь більше 75% м'язів тіла (ходьба, біг, плавання, лижі, ковзани, різні види єдиноборства) – дуже великі біохімічні зрушення за багатьма показниками.

На метаболічні зміни впливає режим м'язової діяльності, який може бути статичним і динамічним. Ці два види м'язової напруги по-різному впливають на кровотік в кінцівках, підсилюючи або уповільнюючи цей процес у венах, і приводячи, таким чином, до погіршення транспорту метаболітів і кисню.

Із збільшенням потужності роботи росте споживання О₂ і наступає момент, коли аеробний механізм не забезпечує енергетичний запит. Цей момент називається порогом анаеробного обміну (ПАНО).

Отже, гліколіз, як механізм енергоутворення, відіграє основну роль при потужності роботи 60 – 85% від максимальної. Виходячи з цього, вправи підрозділяються на 4 зони:

- максимальну – до 30 сек;

- субмаксимальну – до5 хв;

- велику – до 50 хв;

- помірну – до 4-5 годин.