Практична частина Визначення активності лактатдегідрогенази (к.Ф.1.1.1.27) в сироватці крові за реакцією з 2,4-динітрофенілгідразином (метод Севела, Товарек)

Практичне значення роботи: процеси окиснення-відновлення НАД каталізуються ферментами із класу дегідрогеназ. До них відноситься лактатдегідрогеназа (ЛДГ), яка каталізує оборотне перетворення молочної кислоти в піровиноградну, і тим самим сприяє утилізації метаболітів анаеробного обміну.

Принцип методу: L-лактат під дією лактатдегідрогенази сироватки в присутності НАД окиснюється в піруват. При реакції пірувату з 2,4-динітрофенілгідразином утворюється забарвлений гідразон піровиноградної кислоти, інтенсивність забарвлення якого пропорційна активності ферменту.

Матеріали і реактиви: 0,45 М розчин молочнокислого натрію; 2н розчин натрію гідроксиду; 1% спиртовий розчин фенолфталеїну; 0,03М пірофосфат натрію, рН = 8,8; розчин нікотинамід-аденін-динуклеотиду (НАД); розчин 2,4-динітрофенілгідразину (2,4-ДНФГ); 0,4н розчин натрію гідроксиду; 1 н розчин соляної кислоти; стандартний розчин пірувату натрію (CH₃COCOONa).

Хід роботи:

Хід роботи наведений в табл. 9.

Таблиця 9.

Хід підготування дослідної та холостої проби при визначенні активності лактатдегідрогенази в сироватці крові за реакцією з 2,4-динітрофенілгідразином (метод Севела, Товарек)

Інгредієнти	Дослідна проба, мл	Холоста проба, мл
Сироватка крові (розведена 1:2) Розчин НАД	0,1 0,3	- 0,3
Прогрівають 5 хв при 37°С
0,03М розчин пірувату натрію 0,45М розчин лактату натрію	0,8 0,2	0,8 0,2
Інкубують проби 15 хв при 37°С в водяному термостаті
Розчин 2,4-ДНФГ Сироватка крові (розведена 1:2)	0,5 -	0,5 0,1
Витримують 20 хв при кімнатній температурі
0,4Н розчин NаОН	5,0	5,0

Перемішують і через 10 хв. вимірюють на ФЕКі при довжині хвилі 500—560 нм (540 нм, зелений світлофільтр) в кюветі з товщиною шару 10 мм, проти холостої проби.

Розрахунок активності лактатдегідрогенази проводять за калібрувальним графіком.

Побудова калібрувального графіка. З робочого стандартного розчину піровинограднокислого натрію готують ряд розведень, як вказано в таблиці 10. Потім в пробірки підливають по 0,5 мл розчину 2,4-динітрофенілгідразина. Далі стандартні проби обробляють і вимірюють як дослідні.

Таблиця 10.

Методика приготування ряду розведень піровинограднокислого натрію з робочого стандартного розчину

№ п/п	Робочий стандартний розчин пірувату натрію (мл)	0,03М розчин пірувату натрію (мл)	Дистильована вода (мл)	Вміст піровиноградної кислоти в стандартній пробі, мкг	Активність ЛДГ
					О/л	мккат/л
1.	0,1	0,8	0,5	0,88	20	0,33
2.	0,2	0,8	0,4	1,76	40	0,66
3.	0,4	0,8	0,2	3,52	80	1,33
4.	0,6	0,8	-	5,28	120	2,0
5.	0,8	0,6	-	7,04	160	2,66

Холосту пробу ставлять як стандартну, але замість стандартного розчину додають дистильовану воду.

Перерахунок активності лактатдегідрогенази на мкмоль піровиноградної кислоти на 1 л сироватки за 1 хвилину інкубації при 37°С (О/л) проводять за формулою:

,

де С — мікрограми піровиноградної кислоти в пробі;

30·10³ — коефіцієнт перерахунку на 1 л сироватки;

15 — коефіцієнт перерахунку на 1 хвилину інкубації;

88 — вага 1 мкмоля піровиноградної кислоти в мікрограмах.

Прямолінійна залежність між концентрацією піровиноградної кислоти і оптичною щільністю зберігається від 0 до 167 О/л.

Нормальні величини: від 13,3 до 66,7 О/л (0,2—1,1 мккат/л).

Відтворюваність. Коефіцієнт варіації 7%, допустима похибка визначення 20%.

Примітки:

1. Сироватка крові повинна бути вільною не гемолізованою.

2. Для дослідження рекомендується використовувати свіжу сироватку. Фермент не стабільний при зберіганні сироватки при температурі 8—20 °С.

3. Щавельовооцтову плазму вживати не рекомендується, оскільки солі щавлевої кислоти інгібують фермент.

4. ЛДГ — цитозольний фермент з молекулярною масою 135 000. Обернено каталізує окиснення Д-лактата до пірувата. Широко поширений в тваринних клітинах. Тобто, є відносно неспецифічним ферментом, що знижує його діагностичну цінність при визначенні загальної активності. Проте, його ізоферментні форми (ЛДГ₁ — ЛДГ₅) мають високу органну специфічністю і представляють особливий інтерес для діагностики. ЛДГ здатна окиснювати ряд α-гідроксикислот і відновлювати деякі α-кетокислоти, зокрема α-кетобутират. Останній має більшу спорідненість до ЛДГ₁, ніж до ЛДГ₅. Ця властивість покладена в основу α-гідроксибутиратдегідрогеназного тесту, що дозволяє переважно досліджувати активність ЛДГ₁. Окремі ізоферменти ЛДГ по-різному відносяться до дії хімічних і температурних факторів, що робить можливим розділяти їх, не удаючись до електрофорезу. ЛДГ₁ чутливіша і швидше інгібується під дією пірувату і оксалату. Навпаки, ЛДГ₅ чутливіша і швидше інактивується під дією сечовини, ніж ЛДГ₁. До дії теплоти стійкіший ЛДГ₁ в порівнянні з ЛДГ₅. ЛДГ₁ стабільний при температурі 65 °С, при якій інші ізоферменти інактивуються, а при температурі 57 °С інактивується тільки ЛДГ₅.

Клініко-діагностичне значення

Під час повноцінного постачання кисню лактат в крові не накопичується. В умовах гіпоксії (недостачі кисню) при фізичних навантаженнях накопичується, викликає почуття м'язової стомленості, порушує процесс тканинного дихання.

Підвищення активності ЛДГ характерне під час вагітності, у новонароджених і спостерігається після фізичного навантаження. Активність ЛДГ підвищується після прийому алкоголю і деяких лікарських речовин (кофеїну, інсуліну, аспірину, анестетиків і інших). Збільшується активність лактатдегідрогенази (ЛДГ) при інфаркті міокарду, злоякісних новоутвореннях, прогресуючій м'язовій дистрофії.

Зробити висновки:

Контрольні питання:

1. Назвіть причини стомлення при короткочасній роботі максимальної потужності.

2. Вкажіть фактори стомлення при роботі помірної потужності.

3. Які причини стомлення при тривалій роботі?

4. Які метаболіти анаеробного обміну ведуть до розвитку стомлення?

5. Як відбуваються аеробний енергообмін і розвиток стомлення?

6. Яке значення має визначення активності лактатдегідрогенази в сироватці крові у спортивній практиці?

Література:

1. Волков Н.И., Несен Е.Н., Осипенко А.А., Корсун С.Н. Биохимия мышечной деятельности. – Киев: Олимпийская литература, 2000.

2. Мелихова М.А. Динамика биохимических процессов в организме человека при мышечной деятельности: Учеб. пособие/ ГЦОЛИФК. – М., 1992.

3. Моногаров В.Д Генез утомления при напряженной мышечной деятельности // Наука в олимпийском спорте. — 1994. — № 1. — С. 47—57.

4. Таймазов В.А., Марьянович А.Т. Биоэнергетика спорта. – СПб.: Шатон, 2002.

ЛАБОРАТОРНЕ ЗАНЯТТЯ №11

Біохімія репаративних процесів в організмі після фізичного навантаження. Визначення активності холінестерази в сироватці крові колориметричним методом за гідролізом ацетилхолінхлориду і експрес-методом із застосуванням індикаторного паперу

Мета роботи: вивчити процеси в організмі, які відбуваються в період відновлення після фізичного навантаження.

Питання для самопідготовки:

1. Якай взаємозв'язок існує між процесами катаболізму і анаболізму?

2. Яку спрямованість мають зміни концентрації субстратів і метаболітів у відновному періоді?

3. Поясніть взаємозв'язок між концентрацією метаболітів і швидкістю відновлення після фізичного навантаження.

4. Як гормональна система впливає на процеси відновлення?