Завдання №1. Визначення активності креатинкінази в сироватці крові кінетичним методом
Практичне значення роботи: активність фермента свідчить про інтенсивність активації креатинфосфатного ресинтезу АТФ, що має значення при фізичних навантаженнях максимальної потужності.
Принцип методу: базується на постановці непрямого оптичного тесту Варбурга, коли зміна оптичної щільності реакційної суміші пов'язана з переходом окисненої форми НАДФ+ у відновлену — НАДФН, яка реєструється після ряду багатоступінчатих ферментативних реакцій.
Швидкість утворення НАДФН прямо пропорційна активності креатинкінази в пробі.
Матеріали і реактиви
1. Основний реактив:
гексокіназа 3120 О/л
глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа (Г-6-ФДГ) 2064 О/л
НАДФ 2,04 ммоль/л
ЕДТА 2,04 ммоль/л
аденозин-5-дифосфат (АДФ) 2,04 ммоль/л
аденозин-5-монофосфат (АМФ) 5,12 ммоль/л
діаденозин-5-пентофосфат 10,24 мкмоль/л
N-ацетилцистеїн (NAC) 20,40 ммоль/л
креатинфосфат 30,4 ммоль/л
(У наборах оформлений у вигляді ліофілізату).
2. Буферний розчин (рН = 6,8)
імідазол 125 ммоль/л
Д-глюкоза 25 мкмоль/л
ацетат магнію 13 мкмоль/л
3. Робочий реактив.
Ліофілізат основного реактиву (1) розчиняється в 25 мл буферного розчину (2). Стабільний протягом 6 днів при температурі 2 — 8 °С.
Хід роботи:
Склад дослідної та холостої проб див. в табл. 6.
Таблиця 6.
Склад дослідної та холостої проб
Інгредієнти |
Дослідна проба, мл |
Холоста проба (повітря), мл |
Сироватка або плазма Робочий реактив |
0,1 3,0 |
- - |
Перемішати, інкубувати 3 хв. при t° 25 і 30 °С або 2 хв. при t 37 °С. Потім провести колориметрування точно через 1, 2 і 3 хвилини при X = 340 нм і товщині робочого шару кювети 10 мм. Розрахувати зміну екстинкції за 1 хвилину (ΔЕ/хв).
Розрахунок результатів:
Перелічувальні коефіцієнти для різної температури інкубації: 37°/30° - 1,59, 30°/25° - 1,60.
Нормальні величини
чоловіки жінки |
25°С, О/л |
30°С, О/л |
37°С, О/л |
10-70 10-80 |
15-110 15-130 |
25-175 25-200 |
Примітки:
1. За основу узятий набір реактивів фірми ''Cormay", Польща.
2. Якщо ΔЕ/хв більше 0,20, пробу необхідно розвести в 5 разів фізіологічним розчином і повторити вимірювання. Кратність розведення враховується при розрахунках.
3. Гемолізована сироватка (плазма) до дослідження непридатна.
4. Креатинкіназа — фермент з молекулярною масою 81 000, обернено каталізує фосфорилювання креатину за допомогою АТФ. Пряма реакція протікає при рН 9,0, а для зворотної реакції оптимум рН дорівнює 6,8.
Креатинкіназа в істотній кількості виділена з наступних тканин (в порядку зменшення активності): скелетна мускулатура, серцевий м'яз, мозок, щитоподібна залоза, легені. У решті тканин відмічаються тільки слідові кількості цього ферменту.
Клініко-діагностичне значення
Оскільки креатинкіназа є органоспецифічним ферментом скелетної мускулатури і міокарду, визначення загальної активності ферменту застосовують в діагностиці захворювань відповідних органів. Найширше він використовується в діагностиці інфаркту міокарду. Висока активність креатинкінази відмічається при захворюванні скелетної мускулатури: прогресуючій м'язовій дистрофії, дерматоміозитах. Незначне збільшення активності ферменту можливе при міастенії, травмах м'язів (навіть при частих внутрішньом'язових ін'єкціях), після хірургічних операцій.
Деяке збільшення активності ферменту має місце при психічних захворюваннях, але припускають, що більшою мірою це має відношення до м'язової тканини, ніж до мозкової.
Найбільш цінну діагностичну інформацію можна отримати при виділенні ізоферментних фракцій ММ (м'язової) і MB (серцевої).