Практична частина
Визначення адреналіну і норадреналіну (катехоламінів)
у сечі флюориметрично на основі
методів В.О. Осинської (1953 р.) і А.М. Бару (1962 р.)
Практичне значення роботи: гормони мозкового шару наднирників – катехоламіни (адреналін, норадреналін) підвищують рівень глюкози в крові за рахунок активації процесу розщеплення глікогену в печінці під впливом активованої фосфорилази. Таким чином звільнюється глюкоза, яка поступає в кров і компенсує стан гіпоглікемії.
Принцип методу: катехоламіни виділяються з сечі, доведеної до рН 8,2—8,5, шляхом адсорбції на оксиді алюмінію в пробірках, елюються I н розчином сірчаної кислоти, диференціюються окисненням йодом при різних значеннях рН (4,6 і 7,2). Інтенсивність флюоресценції реєструють на флюориметрі.
Для виділення катехоламінів з сечі і очищення їх від домішок використовують принцип адсорбції катехоламінів в лужному середовищі на оксиду алюмінію (А12О3). Найбільший вихід катехоламінів забезпечує оксид алюмінію, оброблений за Брокманом. Особливістю даного методу, його перевагою, яка спрощує дослідження, є те, що адсорбція на оксиді алюмінію виконується не в хроматографічних колонках, а безпосередньо в пробірках. Зручні для цих цілей короткі широкі пробірки (D ≈ 3 см, висота ≈ 6 см) зі скла або, що ще краще, з поліетилену, яким комплектується настільна центрифуга типу ОПН-8. Однією з умов, яка забезпечує повноту адсорбції катехоламінів, є точне дотримання рН в межах 8,2— 8,5, причому перед доведенням рН необхідно видалити солі важких металів. Найбільш придатним для зв’язування іонів важких металів вважається ЕДТА (етилендіамінтетраоцтова кислота), а також її натрієві або калієві солі (хелатон, селектон Б2). До того ж, додавання ЕДТА полегшує адсорбцію катехоламінів на оксиді алюмінію і запобігає їх руйнуванню в лужному середовищі.
Елюація катехоламінів, як було відмічено, здійснюється сірчаною кислотою, їх диференціація виконується за рахунок окиснення йодом. Процес завершується додаванням натрію гідроксиду (NаOH) і аскорбінової кислоти, що призводить до утворення флюоресцуючих продуктів окиснення катехоламінів.
Матеріали і реактиви: етилендіамінтетраоцтова кислота або її двунатрієва сіль (ЕДТА, Трилон Б, хелатон, селектон Б2, версен, комплексен III); насичений розчин сульфату амонію (NH4)2SО4; оксид алюмінію; 1 н розчин натрію гідроксиду; 30% розчин натрію гідроксиду; 1 н розчин сірчаної кислоти; 1% розчин фенолфталеїну; розчин для промивання; ацетатний буфер (рН 4,5—4,6); 50% розчин оцтовокислого натрію; 0,1 н розчин йоду; 0,1 н розчин гіпосульфіту натрію (тіосульфату натрію) Na2S2О4·5H2O; 1% розчин аскорбінової кислоти; стандартні розчини адреналіну і норадреналіну; оцтова кислота 0,2 н; водний розчин еозину в концентрації 0,25 мкг/мл для налаштування флюориметра.
Хід роботи: вимірюють об'єм сечі, виділеної людиною за добу. Відбирають з неї 8 мл, поміщають в центрифужну пробірку, скляну або пластмасову (D ≈ 3 см, висота ≈ 6 см), додають 67 мг ЕДТА і перемішують скляною паличкою до повного розчинення. Проба ставиться обов'язково в паралелях! Одночасно ставиться контроль на реактиви — 8 мл бідистильованої води з 67 мг ЕДТА, який далі обробляється так само, як дослідні проби.
Через 2—3 хв. в кожну пробірку додають 0,2 мл насиченого розчину амонію сульфату, 1 г оксиду алюмінію (зручно відбирати мірною ложечкою), 3—4 краплі розчину фенолфталеїну. Перемішують і обережно підлужнюють 1 н натрію гідроксидом до появи стійкого рожевого забарвлення (рН 8,2—8,5). Потім вміст кожної пробірки перемішують скляною паличкою протягом 2—3 хв і центрифугують 5 хв. при 1,5—2 тис. об/хв. Центрифугат зливають, осад промивають 10 мл розчину для промивання, обережно перемішуючи, і знов центрифугують за тих же умов. Надосадкову рідину зливають. Промивання повторюють ще один раз. На цьому етапі проби з надосадковою рідиною можуть бути залишені в холодильнику до наступного дня.
Після другого промивання центрифугат ретельно зливають з осаду, додають до осаду 8 мл бідистильованої води і 0,2 мл 1 н сірчаної кислоти, знов перемішують 2—3 хв. і центрифугують 5 хв. при 1,5—2 тис. об/хв.
Отриманий елюат розливають в 3 пробірки по 2 мл в кожну для кожної паралельної проби.
Потім приступають до етапу диференціації адреналіну і норадреналіну. Обробку елюату починають з 2-ої і 3-ої пробірок. У 2-у пробірку додають 1 мл ацетатного буфера (рН 4,5), в 3-ю — 0,5 мл 50% оцтовокислого натрію. Перемішують і через 2—3 хв. в 2-у і 3-ю пробірки додають по 5 крапель 0,01 н йоду. Через 30 сек туди ж вносять по 2 краплі 0,1 н розчину гіпосульфіту натрію.
Через 5 хв. після початку обробки елюату у всі пробірки, починаючи з 1-ої, додають по 6 крапель 1% аскорбінової кислоти, збовтують і додають по 1 краплі 30% гідрооксиду натрію, знову збовтують і доливають бідистильованою водою до 10 мл, перемішують, залишають в темноті. Через 15—20 хв після початку обробки елюату вміст всіх пробірок флюориметрують при збудженні світлом (первинний світлофільтр) з довжиною хвилі 360— 400 нм і вторинним світлофільтром 500—550 нм, що дозволяє виділити максимум флюоресценції.
Встановлюють показуючий прилад флюориметра на певному діленні шкали за бідистильованою водою або, що ще краще, за 0,25 мкг/мл розчину еозину. Для цього вказаний розчин еозину інкубують в темноті при кімнатній температурі протягом 10—15 хв. і за ним встановлюють стрілку показуючого приладу на 100 поділок в першому діапазоні чутливості флюориметра (х 1) або на 10 поділок в другому діапазоні чутливості (х 10). Проводять вимірювання калібрувальних розчинів для побудови калібрувального графіка, або для розрахунків за нижченаведеною формулою. Але кожного разу при всіх подальших вимірюваннях дослідних проб заздалегідь проводять налаштування флюориметра за водою або розчином еозину, виводячи стрілку показуючого приладу на раніше встановлену певну поділку шкали. Відлік показань флюориметра при кожному вимірі повторюють кілька разів і враховують максимальний, оскільки інтенсивність флюоресценції міняється — дещо наростає, а потім знижується. У кожній з трьох пробірок дослідної проби — флюоресценція 1-ої пробірки обумовлена некатехоламінами. У 2-ій пробірці флюоресцують продукти перетворення адреналіну і некатехоламіни. У 3-ій пробірці флюоресцують продукти перетворення адреналіну, норадреналіну і некатехоламінів. Таким чином, різниця між інтенсивністю флюоресценції в 2-ій і 1-ій пробірках може бути віднесена за рахунок адреналіну, а між 3-ою і 2-ою — за рахунок норадреналіну. Віднімають контроль на реактиви (обробка дистильованою водою), він зазвичай дорівнює нулю.
Розрахунок вмісту адреналіну і норадреналіну в добовій сечі проводиться за наступною формулою:
де Е2(3) - Е1(2) — різниця між екстинкціями, отриманими на флюориметрі для кожної з трьох пробірок;
8,25 — кількість елюату після центрифугування в кожній пробірці;
Д — діурез в мл за добу;
С — кількість речовини в стандарті (адреналіну або норадреналіну на 1 поділку шкали показуючого приладу — "ціна поділки" в мкг;
2 — кількість узятого для дослідження елюату;
8 — кількість сечі, узятої для дослідження;
10 — останнє розведення сечі.
Для позначення результату в нмоль/добу значення, отримане в мкг/добу помножують на коефіцієнт перерахунку: для адреналіну — 5,458, для норадреналіну — 5,911.
Стандартні розчини адреналіну і норадреналіну обробляють як дослідні проби, починаючи з етапу диференціації. З приготованого розчину 1 мкг/мл береться два розведення — 0,1 мл на 10 мл бідистильованої води і 0,2 мл. Отримують розчини 0,1 мкг/мл і 0,2 мкг/мл, які вводяться в дослідження.
Нормальні величини. Для адреналіну 16,4-81,8 нмоль/добу (3-15 мкг/добу); для норадреналіну 59,1-236,4 нмоль/добу (10-40 мкг/добу).
Примітки:
1. Для дослідження сечі на катехоламіни необхідно за 2—3 дні до цього виключити з їжі деякі продукти: банани, ананаси, сири, міцний чай, каву, шоколад, а також наступні медикаменти: антибіотики тетрациклінового ряду, аспірин, хінін, альдомет, резерпин, седуксен, еленіум, меліпрамін, психотропні речовини тіазинового ряду, адреноблокатори.
Виключаються в цей період інструментальні дослідження і інші фактори, які викликають фізичну або емоційну напругу у досліджуваного.
2. При неможливості виконати дослідження в день доставки сечі допускається її зберігання протягом 2—3 днів в замороженому стані. Для цього вимірюють її об'єм, відбирають невелику кількість (приблизно 100 мл) в чистий скляний посуд і поміщають в морозильну камеру холодильника.
3. При необхідності, можна досліджувати катехоламіни не тільки в добовій сечі, але і за окремі обумовлені проміжки часу протягом доби. Для цього у формулу розрахунку, замість об'єму добової сечі, вводять об'єм сечі в мл, виділеної за конкретний часовий проміжок. Отриманий результат ділять на час збору сечі в хвилинах. Як одиницю позначення вказують нмоль/хв.
Клініко-діагностичне значення
Підвищується концентрація катехоламінів при інфаркті міокарду, черепно-мозковій травмі, кетоацидозі у хворих цукровим діабетом. Збільшення відбувається при хронічному алкоголізмі, маніакальній фазі маніакально-депресивного психозу. Зниження концентрації має місце при недорозвиненні мозкової речовини надниркових залоз, гострій і хронічній нирковій недостатності, паркінсонізмі, депресивній фазі маніакально-депресивного психозу.
До катехоламінів відноситься група амінів, яка містить в молекулах ядро пірокатехину (катехолу) і представлена, головним чином, трьома сполуками: адреналіном, норадреналіном і дофаміном. Вони є гормонами симпато-адреналової системи, утворюються клітинами мозкового шару надниркових залоз. Адреналін, крім власне синтезу в хромафінній тканині, частково утворюється при метилюванні норадреналіну. Норадреналін продукується мозковим шаром надниркових залоз, різними ділянками головного мозку і симпатичною нервовою тканиною. Норадреналін служить медіатором симпатичної нервової системи. Дофамін — попередник норадреналіну і також є медіатором симпатичної нервової системи. Дофамін локалізується в центральній нервовій системі, легенях, кишечнику, печінці. Схематично утворення катехоламінів в організмі представляють таким чином: фенілаланін → тирозин → діоксифенілаланін (ДОФА) → дофамін → норадреналін → адреналін. Вміст катехоламінів в плазмі здорової людини невеликий — в одному літрі плазми венозної крові знаходиться близько 1 мкг катехоламінів, які дуже короткочасно циркулюють в крові і швидко елімінуються.
Фізіологічний ефект дії катехоламінів проявляється впливом на тонус і скорочення гладенької і поперечно-смугастої мускулатури, судинний тонус, серце, дихання, обмін вуглеводів і жирів. Норадреналін викликає збудження гладеньком'язової тканини судин і, як наслідок, їх звуження з підвищенням артеріального тиску. Адреналін підвищує систолічний тиск, тоді як діастолічний залишається в нормі або знижується. Під впливом адреналіну відбувається звуження деяких судин, зокрема судин шкіри, а інші — наприклад, судини скелетної мускулатури, розширюються. Катехоламіни збільшують глибину дихання, розслаблюючи мускулатуру бронхів і знижуючи опір повітряносних шляхів, що використовується в лікуванні бронхіальної астми. При стресі або значній гіпоглікемії різко зростає концентрація адреналіну в плазмі. Катехоламіни здійснюють сильний хронотропний і інотропний ефект на серце.
Зробити висновки.
Контрольні питання:
1. Як відбувається регуляція обміну речовин?
2. Який вплив здійснює нервова система на біохімічний стан організму?
3. Опишіть механізми нейроендокринної регуляції м'язового скорочення.
4. Охарактеризуйте роль гормонів щитоподібної і підшлункової залоз при фізичній роботі.
5. Як впливають адреналіну і норадреналіну на обмін глюкози при фізичних навантаженнях?
Література:
1. Березов Т.Т., Коровкин В.В. Биологическая химия. — М.: Медицина, 1998. — 543 с.
2. Бернштейн Н.А. Очерки по физиологии движений и физиологии активности. – М.: Физкультура и спорт, 1966. – 135 с.
3. Биохимия гормонов и гормональной регуляции./Под ред. Н.А. Юдаева. – М.: Наука, 1976.
4. Виру А.А., Кирге П.К. Гормоны и спортивная работоспособность. — М.: Физкультура и спорт, 1977. — 160 с.
5. Маликов Н.В. Адаптация: проблемы, гипотезы, эксперименты. – Запорожье, 2001. – 371 с.
6. Меерсон Ф.З. Основные механизмы индивидуальной адаптации // Физиология адаптационных процессов. — М.: Наука, 1986.
7. Таймазов В.А., Марьянович А.Т. Биоэнергетика спорта. – СПб.: Шатон, 2002.
8. Физиологическое тестирование спортсмена высокого класса/ Под ред. Дж. Дункана МакДугалла, Говарда Е. Уэнгера, Говарда Дж. Грина. — Киев: Олимпийская литература, 1998. — 430 с.
СЕМІНАРСЬКЕ ЗАНЯТТЯ № 8
Контроль знань з модулю №3