Практична частина

Визначення піровиноградної кислоти в крові модифікованим методом Умбрайта

Практичне значення роботи: процес розпаду молекули глюкози в організмі людини до піровиноградної кислоти протікає однаково в анаеробних і аеробних умовах. Утворена в гліколітичній стадії піровиноградна кислота при достатній кількості кисню підпадає далі окиснювальному декарбоксилюванню, в результаті чого утворюються макроергічна сполука ацетил-КоА, відновлена форма НАДН₂ і одна молекула СО₂. Якщо в процесі гліколізу утворилася молочна кислота, то в аеробних умовах вона перетворюється в піровиноградну кислоту. Ацетил-КоА далі включається в цикл лимонної кислоти, де його ацетильна група розщеплюється до СО₂ и Н₂О, а КоА вивільняється і поєднується з новою молекулою піровиноградної кислоти. Таким чином, цикл повторюється.

Принцип методу: піровиноградна кислота (ПВК) крові конденсується з 2,4-динітрофенілгідразином з утворенням гідразона, який в лужному середовищі дає коричнево-червоне забарвлення розчину. За інтенсивністю його забарвлення роблять висновок про вміст піровиноградної кислоти.

Матеріали і реактиви: пробірки, піпетки, центрифуга, розчин трихлороцтової кислоти (ТХО) – 10г/100мл, розчин 2,4-динітрофенілгідразину (ДНФГ), розчин натрію гідроксиду – 12г/100мл, піровінограднокислий натрій (піруват натрію).

Хід роботи: З безіменного пальця руки беруть 0,3 мл крові і змішують в центрифужній пробірці з 0,7 мл дистильованої води. До гемолізату додають 1 мл розчину ТХО, перемішують скляною паличкою і через 2-3 хв. центрифугують при 1500 об./хв. впродовж 15 хв. Надосадкову рідину повністю зливають в пробірку, до неї додають 0,4 мл розчину ДНФГ, вміст пробірки перемішують і на 20 хв. поміщають в темне місце при кімнатній температурі. Потім в пробірку підливають 1 мл розчину натрію гідроксиду і через 5 хв. визначають на фотоелектроколориметрі (ФЕК) оптичну щільність забарвленого реактиву. Як компенсаційну рідину беруть контрольний розчин, який готують так само, як і експериментальний, тільки замість крові використовують воду. Колориметрують проби на ФЕКі з синім світлофільтром в кюветах з шириною шару 5 мм. Кількість ПВК в досліджуваній пробі розраховують за калібрувальною кривою.

Калібрувальну криву будують, враховуючи, що 1 ммоль ПВК відповідає 88 мг ПВК, а в нормі в крові міститься до 0,144 ммоль/л ПВК.

Клініко-діагностичне значення

Рівень ПВК, зазвичай, росте одночасно із зростанням рівня лактату. У адаптованих спортсменів під час фізичних навантаженнях рівень пірувату зростає в середньому на 20-30%. Ознакою розтренованості є зростання рівня пірувату в два рази, або падіння його концентрації нижче початкового рівня.

Зробити висновки.

Контрольні питання:

1. Опишіть будову мітохондрій. Які ферментативні процеси протікають в них?

2. Охарактеризуйте цикл трикарбонових кислот (Кребса). Вкажіть основні субстрати і метаболіти.

3. Яке значення має кисень в реакціях дихального ланцюга?

4. Вкажіть енергетичні можливості аеробного ресинтезу АТФ.

5. Розкрийте значення міоглобіну в аеробному обміні.

6. Яке значення має визначення піровиноградної кислоти в крові у спортсменів?

Література:

1. Волков Н.И., Несен Е.Н., Осипенко А.А., Корсун С.Н. Биохимия мышечной деятельности. – Киев: Олимпийская литература, 2000.

2. Иванов К.П. Основы энергетики организма. — Л.: Наука_: 1990. — 307 с.

3. Мелихова М.А. Динамика биохимических процессов в организме человека при мышечной деятельности: Учеб. пособие/ ГЦОЛИФК. – М., 1992.

4. Таймазов В.А., Марьянович А.Т. Биоэнергетика спорта. – СПб.: Шатон, 2002.