19. Genetické mapování, cytogenetické a fyzické mapy

hlavní kroky přípravy preparátů pro cytogenetickou analýzu a na čem je založeno pruhování ch.

- stimulace a synchronizace buněčného dělení, zachycení chromozomů v mitotické metafázi

- oddělení chromozomů (hypotonický roztok), rychlé usmrcení a fixace buněk, macerace

- nanesení na podložní sklíčko, barvení chromozomů – homogenní barvení, pruhování chromozomů

- pruhování – tradiční barvení, kterému předchází denaturace chromozomů, následovaná renaturací

- pro každý chr. – unikátní vzor pruhování; zastoupení AT/CG bází -> organizace chromatinu

pojmy karyotyp, karyogram, ideogram, znát základy cytogenetické nomenklatury

- karyotyp – soubor všech chromozomů v jádře buňky

- karyogram – úplný soubor všech mitotických metafázických chromozomů

- uspořádaných podle velikosti a polohy centromery (tj. uspořádaný karyotyp)

- ideogram - schematické znázornění karyogramu, znázornění pruhů, číslování pruhů od centromery

na jakém principu je založena metoda FISH + k čemu jí (a její varianty) lze v cytogenetice využít (včetně malování chromozómů)

- FISH = fluorescenční in situ hybridizace – místně specifická hybridizace DNA

- s komplementár., fluorescenčně značenými jednořetězc. sondami-> vizualizace specif. úseků DNA

- sondy pro FISH - lokus specifické (pro unikátní sekvence); satelitní (specifické pro chromozom)

- malovací - celochromozomové a parciální

- malování chromozomů – m-FISH, SKY; sady malovacích sond specifické pro jednotlivé ch.

-> identifikace jednotlivých chromozomů, detekce chromozomových přestaveb

- mBAND – sady malovacích sond specifické pro určité oblasti jednotlivých chromozomů

-> pruhovací vzor -> mapování

na jakém principu jsou založeny mapy vzniklé na základě radiačních hybridů, restrikční a kontigové

- ozáření somatických buněčných kultur X nebo gama zářením -> fúze somatických buněk ze 2 druhů

- čím blíže jsou 2 lokusy u sebe, tím je větší pst, že budou na stejném fragmentu DNA (v 1 RHybridu)

- vzájemné srovnání dvojic lokusů -> pořadí a vzdálenosti

- restrikční mapy – počet, pořadí a vzdálenosti mezi restrikčními místy (rozpoznávacími místy)

- kontigové mapy – kontig = soubor částečně se překrývajících úseků DNA seřazených za sebou

- řazení kontigů - srovnání restrikčních map, sekvenčně specifi. sondy, fiber-FISH, přímé sekvenování

co znamenají zkratky STS, EST

- STS marker - místo se sekvenční adresou; unikátní , sekvenčně definovaná místa na DNA

- markery při sestavování map a při jejich propojování (funguje jako kotvící marker)

- EST marker - STS reprezentující pouze exprimované části genomu (tj. části genů)

co je syntenie a syntenní mapy

- syntenie –umístění různých lokusů na stejném chromozomu -> bloky lokusů, které jsou společné

- synténní bloky lokusů mohou být v rámci jednoho/mezi různými genomy

- syntenie = evolučně zachované bloky lokusů mezi různými organismy

20. Sekvenování dna

- plná sekvence DNA = konečný, nejvíce detailní typ fyzické mapy

na jakém principu je založena polymerázová řetězová reakce (PCR) (v základním provedení)

- vysoká citlivost, rychlost, jednoduchost, ale musíme znát sekvenci ohraničující úsek DNA

- proveditelná pouze u krátkých úseků, potřebujeme k tomu primery

(oligonukleotidy komplementární s hraničními sekvencemi) a termostabilní DNApolymerázu

1) denaturace DNA teplem2) připojení primerů 3) DNApolymeráza nareplikuje úseky DNA

- tyto kroky se opakují a dochází k amplifikaci (rozmnožení).

na jakém principu je založena dideoxy (Sangerova) metoda sekvenování DNA

- přidají se k DNA 4 terminátory a vzniknou různé segmenty DNA zakončené vždy jinou bazí (AGCT)

- udržuje se poměr terminátorů, vznikají různě dlouhé segmenty, ty se pak elektroforézou oddělí (nejmenší dojdou nejdál), vytvoří se pruhy

co to jsou tzv. sekvenovací technologie nové generace a jaké jsou jejich hlavní kroky/vlastnosti

- rychlejší, lacinější, efektivnější; klasické metody náročné na sekvenování celého genomu

na jakém principu je založeno pyrosekvenování, sekvenování pomocí reverzibilních terminátorů a sekvenování pomocí ligace

- Pyrosekvenování – když se nukleotid začleňuje do DNA sekvence, vydává světelné záření, detekuje se luciferinem, DNA se amplifikuje a sleduje se záření, není nutná elektroforéza

- Sekvenování pomocí ligace – zjištění bazí pomocí ligace (zaškrcení)

jaké jsou jednotlivé kroky sestavování celogenomové sekvence

- sestavení sekvence, zaplnění mezer,odstranění chyb, opakované sekvenování -> úplná sekvence

co znamená anotace sekvence = identifikace genů, regulačních sekvencí, transponovatelných elementů, repetitivních sekvencí, určení funkce genových produktů..