Содержания занятия:
Контроль исходного уровня знаний и умений.
Разбор с преподавателем узловых вопросов, необходимых для освоения темы занятия.
Демонстрация преподавателем методики практических приемов по данной теме.
Дерматоглифический метод исследования генетики человека
Д
Папиллярные гребни на различных участках гребешковой кожи образуют узоры разного типа и ориентации. Узоры изучают на отпечатках,
ерматоглифический анализ — это изучение папиллярных узоров пальцев, ладоней и стоп. На этих участках кожи имеются крупные дермальные сосочки, а покрывающий их эпидермис образует гребни и борозды. Дерматоглифические узоры обладают высокой степенью индивидуальности и остаются неизменными в течение всей жизни. Поэтому их используют для определения зиготности близнецов, для идентификации личности в криминалистике и установления отцовства в судебной медицине. Трудности использования дерматоглифического анализа в медицине заключаются в отсутствии специфических изменений дерматоглифики при определенных заболеваниях. В медико-генетических консультациях дерматоглифический анализ чаще используется в качестве экспресс-метода диагностики некоторых геномных мутаций (болезни Дауна), реже - хромосомных мутаций.
сделанных на бумаге, после нанесения на кожу типографской
краски. На пальцевых подушечках имеются узоры трех типов: дуги (А - агсЬ),
петли (Ь - 1оор) и завитки (XV - \уЬог1).
Для большинства узоров характерна дельта (трирадиус) - место схождения трех разнонаправленных папиллярных линий. Дуга представляет собой открытый, бездельтовый узор; петля - замкнутый с одной стороны, однодельтовый узор; завиток - полностью замкнутый, двухдельтовый узор. Иногда встречаются комбинированные сложные узоры. Количественным показателем узора является гребневый счет - число папиллярных линий между дельтой и центром узора. Гребневый счет дугового узора равен нулю. Узоры, аналогичные пальцевым, имеются и на ладонях - в области тенора и гипотенора и на II, III, IV и V межпальцевых промежутках.
В межпальцевых промежутках имеются трирадиусы (а, Ь, с, с1), а вблизи браслетной складки расположен главный ладонный трирадиус 4. Если соединить трирадиусы а, с1 и I, то получим главный ладонный угол а&1, который в норме не превышает 57°. На ладони различают три главные флексорные (сгибательные) борозды: борозды большого пальца, косая и поперечная. Иногда косая борозда сливается с поперечной в одну четырехпальцевую борозду (ЧПБ). Частота ее встречаемости в норме не превышает 5%. Совокупность радиальных петель на IV и V пальцах, четырехпальцевой борозды и главного ладонного угла свыше 60°-80° свидетельствует о врожденной компоненте наследственного заболевания.
Цитогенетический метод в исследовании генетики человека
Среди многих методов изучения наследственной патологии человека цитогенетический метод занимает существенное место. С помощью цитогенетического метода возможен анализ материальных основ наследственности и кариотипа человека в норме и патологии, изучение некоторых закономерностей мутационного и эволюционного процессов.
Методы цитогенетического анализа
Изучение ядер делящихся клеток (кариотипиропание)
а) исследование метафазных клеток прямым методом - хромосом в клетках костного мозга.
б) исследование метафазных клеток непрямым методом (культуры клеток периферической крови, кожи, фибробластов и др.).
Этапы метода
Культивирование клеток крови (лимфоцитов) периферической крови на искусственных питательных средах, с добавлением ФГА (фитогемагглютинина), стимулирующего митозы. В норме лимфоциты периферической крови, как правило, не делятся, находясь в стадии покоя (интерфазы). Под действием ФГА происходит их иммунологическая трансформация и они начинают активно делится.
Добавление в среду культивирования колхицина для разрушения нитей веретена деления и остановки митоза на стадии метафазы, когда хромосомы наиболее спирализированы.
Обработка клеток гипотоническим раствором хлорида натрия, вследствие чего хромосомы рассыпаются и лежат свободно.
Окрашивание хромосом, которые становятся различимыми при микроскопировании. Исследуют не менее 100 метафазных пластинок.
Анализируют кариотип после фотографирования, вырезания хромосом и построения идиограммы. В настоящее время используются современные микроскопы, способные выводить с помощью ряда компьютерных программ изображение на монитор компьютера для последующего анализа.
Препараты хромосом окрашивают рутинным методом (равномерная окраска) используя азуры, основной фуксин, орсеин и др. На основе рутинной окраски хромосомы распределяются по группам (от А до О) согласно Международной Денверской классификации. Денверская классификация хромосом позволяет определить принадлежность хромосомы к той или иной группе и выявить грубые хромосомные нарушения.
В настоящее время для точной идентификации каждой хромосомы применяют методы дифференциального окрашивания хромосом. При д, показывая, что каждая пара хромосом имеет специфический характер чередования неокрашенных, светло - и темноокрашенных дисков.
В основе Парижской номенклатуры лежит дифференциальная окраска. Для дифференциального окрашивания используют флюрохромы и основные нефлюорисцируюшие красители (окраска по Романовскому - Гимза). Используют следующие методы дифференциального окрашивания хромосом:
О-окрашивание - окрашивание акрихин-ипритом с исследованием под флуоресцентным микроскопом. Чаще всего применяется для исследования У- хромосом (быстрое определения генетического пола, выявление транслокаций между X- и У-хромосомами или между У-хромосомой и аутосомами, скрининг мозаицизма с участием У-хромосом)
С-окрашивание - модифицированное окрашивание по Романовскому - Гимзе. Чувствительность выше, чем у О-окрашивания, поэтому используется как стандартный метод цитогенетического анализа. Применяется при выявлении небольших аберраций и маркерных хромосом (сегментированных иначе, чем нормальные гомологичные хромосомы) При С-окраске число, величина и расположение сегментов в хромосоме аналогично рисунку при О-окраске.
К-окрашивание - используется акридиновый оранжевый и подобные красители, при этом окрашиваются участки хромосом, нечувствительные к С- окрашиванию. К - сегменты окрашиваются после контролируемой тепловой денатурации. Используется для выявления деталей гомологичных С- или О- негативных участков сестринских хроматид или гомологичных хромосом.
С-окрашивание - применяется для анализа центромерных районов хромосом, содержащих конститутивный гетерохроматин) и вариабельной дистальной части У-хромосомы.
По локализации выделяют 4 типа С-хроматина
собственно центромерный ,
гетерохроматин вторичных околоцентромерных перетяжек аугосом 1, 9, 16;
гетерохроматин коротких плеч акроцентрических аутосом
гетерохроматин длинного плеча У - хромосомы.
Рисунок каждой хромосомы специфичен по числу, положению, размерам, окрашенных сегментов.
Р18Н-метод окраски хромосом
РШН-метод разработан в Ливерморской национальной лабораторией (США) в 1986 г. Это принципиально новый метод изучения хромосом - метод флюоросцентного выявления ДНК путем гибридизации т вки со специфическими молекулярными зондами (Р18Н). Метод основан на способности хромосомной ДНК связываться при определенных условиях с фрагментами ДНК (ДНК-зондами), которые включают нуклеотидные последовательности, комплементарные хромосомной ДНК. ДНК-зонды предварительно метят специальными веществами (например, биотином или дигоксигенином). Меченные ДНК-зонды наносят на цитогенетические препараты подготовленных дня гибридизации (денатурированных) метафазных хромосом. Предварительная обработка хромосом необходима для облегчения доступа ДНК-зонда к геномной ДНК. После того как произошла гибридизация, препараты обрабатывают специальными флюросцентными красителями, конъюгированными с веществами, способными избирательно присоединяться к биотину или дигоксигенину. Для биотина таким веществом является стрептавидин, а для дигоксигенина -антидигоксигенин. В качестве красителей обычно используют флюоресцеин-иютиоционат-ПТС, метил-кумарин-3- уксусную кислоту АМСА и др. Гибридизация может проводиться также с зондами меченными радиоактивной меткой. Цитогенетический анализ проводится под люминесцентным микроскопом в ультрафиолетовом свете. Р18Н-метод используется для выявление мелких делеций и транслокаций. Хромосомные обмены (транслокации и дицентрики) между разноокрашенными хромосомами легко определяются как двухцветные структуры. Для идентификации транслокаций (с одной центормерой) и дицентриксв (с двумя центромерами) одновременно с хромосомными ДНК-зондами используют также ДНК-зонды к центромерным участкам хромосомы (панцентромерные
пробы). При использовании одного флюоресцентного красителя для ДНК- зондов обычно метят около 20% генома, т.е. не более 3 хромосом, и выявленные таким образом хромосомные нарушения для анализируемой части генома пересчитывают не весь геном в целом. Современные методические возможности позволяют увеличить число цветов, что в свою очередь дает возможность увеличить долю окрашенных хромосом в геноме и повысить точность исследования. ->
Самостоятельная работа студентов под контролем преподавателя.
ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА
Просмотр демонстрационного препарата «Кариотип человека» в цитогенетической лаборатории
При увеличении 90* в поле зрения видны лейкоциты, которые имеют округлую форму, компактное округлой формы темноокрашенное ядро, окруженное широким ободком светлоголубой цитоплазмы. Среди них найдите хромосомы, лежащие вне клеток в виде скопления - метафазная пластинка. Найдите метацентрические, субметацентрические и акроцентрические хромосомы.
Анализ кариотипа у больных с хромосомными болезнями (по фотографиям)
№ 1. трисомия по 13 хромосоме (синдром Патау). Кариотип 47, +13.
№ 2. трисомия по 18 хромосоме (синдром Эдвардса). Кариотип 47, +18.
№ 3. трисомия по 21 хромосоме (болезнь Дауна). Кариотип 47, +21.
№ 4. деления короткого плеча одной из хромосом 5 пары (синдром «кошачьего крика»), Кариотип 46, 5р- № 5. полисомия Х-хромосомы у женщин. Кариотип: 47, XXX или 48, ХХХХ № 6. полисомия Х-хромосомы у мужчин (синдром Клайнфельтера). Кариотип: 47, ХХУ, 48, ХХХУ - № 7. моносомця по Х-хромосоме (синдром Шершевского -Тернера). Кариотип: 45, ХО.
Разобрать с преподавателем механизм возникновения транслокационной формы болезни Дауна (кариотип 46, 15+‘').
З.Лабораторная работа