Проведение занятия

1. Теоретические вопросы окрашивания кислотоустойчивых и спорообразующих микроооганизмов

2. Демонстрация анимации «Окраска по Цилю-Нильсену»

3. Демонстрация мазков кислотоустойчивых бактерий, окрашенных по Цилю-Нильсену

4. Демонстрация окраски спор по Цилю.

5. Контрольные вопросы

Задание

Каждый студент должен:

Приготовить и рассмотреть под микроскопом в иммерсионной системе:

1. Мазок из кислотоустойчивых бактерий в окраске по Цилю-Нильсену:

2. Мазок из спорообразующих бактерий в окраске по Цилю:

   • мазок высушить на воздухе, фиксировать на пламени

   • покрыть полоской фильтровальной бумаги, на которую нанести карболовый раствор фуксина Циля

   • подогреть в течении 6-8 минут до образования паров (краску периодически добавляют, не давая мазку подсохнуть

   • мазок тщательно промыть водой

   • на 30-60 секунд нанести на него солянокислого алкоголя (96^о этилового спирта, содержащего по объему 3% соляной кислоты), доведя оттенок препарата до слабо розоватого

   • промыть мазок водой

   • докрасить метиленовой синькой Леффлера в течении 5 минут

   • промыть водой, высушить на воздухе и микроскопировать

3. Зарисовать в тетради микроорганизмы, видимые в поле зрения.

Контрольные вопросы (письменный ответ в тетради):

1. Чем объясняется кислотоустойчивость бактерий?

2. Какие бактерии относятся к кислотоустойчивым?

3. Какие свойства спор отличают их от вегетативных клеток?

4. Какие бактерии относятся к спорообразующим?

Лабораторное занятие №4

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В МИКРОБИОЛОГИИ (продолжение)

Цель – ознакомление с методами окраски капсулы и включений бактерий.

Материалы и оборудование: бактериологическая петля, предметные стекла, пробирки, ватные пробки, спиртовка или газовая горелка, растворы красителей

Капсула бактерий. При определенных условиях культивирования многие виды бакте­рий различных таксономических групп образуют слизистое вещество, формирующее вокруг клетки структуру, которая называется капсу­лой. Колонии капсулообразующих бактерий имеют влажную, блестя­щую поверхность и называются мукоидными. Среди сапрофитных бактерий капсула хорошо выражена у представителей родов Azotobacter, Leuconostoc, Rhizobium, патогенных - Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Bacillus anthracis и др.

Капсула предохраняет клетку от обезвоживания, механического по­вреждения, капсульное вещество создает вокруг клетки дополнитель­ный осмотический барьер, регулирующий поступление и выделение различных веществ и ионов, а также аэрацию бактерий. Лучше всего капсулы выявляются во влажных препаратах, так как составляющие их сильно гидратированные коллоидные полимеры легко разрушают­ся и сокращаются в размерах при высушивании и фиксации.

Окраска капсул по методу Ребигера. На высушенный мазок наносят краску Ребигера, окрашивают 40 сек – 1 мин. Препарат промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют. Клетки бактерий, окрашенные в синий цвет, окружены бесцветными или слабо-розовыми капсулами.

Окраска капсул по методу Гинса. На хорошо обезжиренное предметное стекло (ближе к его концу) с помощью пастеровской пипетки или микробиологической петли помещают каплю черной ту­ши, в нее вносят исследуемый материал. Жидкость перемешивают и ребром второго предметного или покровного стекла делают ма­зок по поверхности первого. Мазок высушивают на воздухе, фик­сируют смесью Никифорова в течение 5-10 минут и окрашивают раствором карболового фуксина Циля, разбавленного водой 1:3, в течение 2-3 минут. Препарат промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют. На темно-сером фоне препарата конт­растно выделяются розово-малиновые клетки бактерий, окружен­ные бесцветными капсулами.

1

2

Рис.1. Капсула сибиреязвенного микроба. (1) - прижизненная окраска тушью (2) -окраска люминесцирующей капсульной сывороткой

Выявление капсул на негативном прижизненном препарате (негативное контрастирование). На хорошо обезжиренное предметное стекло помещают (в центре) кап­лю неразведенной черной туши и вносят в нее каплю исследуемо­го материала. Смесь тщательно перемешивают и накрывают покровным стеклом, осторожно прижимая к предметному полоской фильт­ровальной бумаги. Препарат микроскопируют, пользуясь объекти­вом МИ-90. На темном фоне выявляются прозрачные неокрашенные зоны капсул вокруг микробных клеток.

Выявление некоторых цитопазматических (внутриклеточных) включений. У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в ре­зультате обменных процессов в цитоплазме образуются отложения, которые называют включениями. Среди них - кристаллы щавелевой кислоты, зер­нышки аморфного карбоната кальция, отложения жира, поли-β-гидрооксимасляной кислоты, полифосфатов, полисахаридов, гранулы углеводной природы - гликоген (животный крахмал) и гранулеза (крахмало-подобное вещество), се­ры и различных кристаллов. Эти включения представляют собой продукты клеточного обмена; одни из них следует рас­сматривать как запасные питательные вещества, другие - как отходы метаболизма клетки. Для выявления этих включений, которые сильно преломляют свет, применяется несколько методов.

Гра­нулы волютина или метахроматические зерна (метахроматин) представлены полифосфатами и веществами, близкими к нуклеиновым кислотам - запасающимся веще­ством, которое служит источником фосфатных групп. В них сосредоточены запасы фосфора. Волютин обнаруживается в виде крупных гранул в ваку­олях дрожжей или цитоплазме бактерий (уксуснокислых, молочнокислых, азотфиксирующих) и актиномицетов. Название «волютин» произошло от Spirillum volutans, в клетках которой он был впервые обнаружен.

Включения волютина хорошо выражены у Spirillum volutans, Bacil­lus subtilis, молочнокислых бакте­рий, дрожжей, в клетках Asotobaster, а также у возбудителей сибирской язвы и дифтерии. Гра­нулы волютина имеют относительно крупные размеры, окрашиваются различными красителями, изменяя цвет последних. Например, при окрашивании метиленовым синим волютин окрашивается в ярко-красный цвет. Такое явление получило название метахромазии.

Окраска волютина по методу Омелянского. Тонкий мазок ис­следуемого материала высушивают на воздухе, фиксируют на пла­мени, окрашивают раствором карболового фуксина 30-40 сек. и промывают водой. Затем препарат дифференцируют, погружая его в склянку с 1% серной кислотой, или наливают ее на поверхность препарата на 20-30 сек. и немедленно промывают водой. Серная кислота обесцвечивает цитоплазму, а зерна валютина остаются окрашенными фуксином. Препарат докрашивают раствором метиленовой сини Леффлера (1:40) 20-30 секунд, промывают водой, высу­шивают на воздухе и микроскопируют, пользуясь объективом МИ-90. На препарате зерна валютина окрашены в красный цвет, цито­плазма клетки - в голубой.

Окраска волютина по методу Леффлера. Тонкий мазок культу­ры микроорганизма высушивают на воздухе, фиксируют на пламени, окрашивают раствором метиленовой сини Леффлера в течение 3-х минут, промывают водой, и рассматривают, пользуясь объективом МИ-90. На пре­парате зерна волютина окрашены в красновато-фиолетовый цвет, а цитоплазма - в голубой.

Окраска волютина по методу Нейссера.

Фиксированные мазок окрашивают уксусно-кислым метиленовым синим, выдерживают 1 минуту, промывают водой. Наливают раствор Люголя на 20 – 30 сек, сливают. Окрашивают везувином 1-3 мин, промывают водой и высушивают. Цитоплазма – желтая, зерна волютина – темно-синие.

Рис.2. Мазок из чистой культур Corynebacteria diphteria. Окраска по Нейссеру

Окраска гранулезы и гликогена. На предметное стекло нано­сят каплю исследуемого материала, добавляют каплю раствора Люголя, накрывают покровным стеклом и микроскопируют в иммерсионной системе. Включения гранулезы в бактериальной клетке окрашиваются в темно-синий цвет.

Для выявления гликогена готовят тонкий мазок, высушива­ют на воздухе, фиксируют смесью Никифорова в течение 5 ми­нут. Мазок окрашивают концентрированным раствором Люголя в течение 30-40 сек., промывают водой, накрывают покровным стеклом и микроскопируют, пользуясь объективом МИ-90. Грану­лы гликогена окрашиваются в красновато-коричневый цвет. Если препарат нагреть до 60⁰, окраска гликогена исчезает, а при охлаждении препарата восстанавливается.