Светлопольная микроскопия

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при исследовании прозрачных препаратов, у которых различные участки структуры по-разному поглощают свет. Пучок лучей из осветительной системы проходит препарат и объектив и дает равномерно освещенное поле в плоскости изображения. Элементы структуры препарата частично поглощают и отклоняют падающий на них свет, что и обусловливает появление изображения. Метод может быть полезен и при наблюдении непоглащающих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив. Метод светлого поля в отраженном свете применяется для наблюдения непрозрачных объектов, к примеру, травленых шлифов металлов, биологических тканей и различных минералов. Освещение препарата производится сверху, через объектив, который одновременно выполняет и роль осветительной системы. Изображение, как и при проходящем свете, создается за счет того, что разные участки препарата неодинаково отклоняют падающий на них свет, а отраженные лучи имеют различную интенсивность.

Устройство биологического микроскопа. Для изучения микроорганизмов пользуются сложными оптически приборами — микроскопами (от греч. mikros — малы, skopeo— смотрю). Микроскопы имеют две основные части: механическую и оптическую.

Механическая часть состоит из штатива, котором различают ножку (или башмак), основание, тубусодержатель, и предметного столика, прикрепляемого к основанию штатива. Предметный столик перемещается в горизонтальной плоскости с помощью винтов. На поверхности сто лика имеются две клеммы для закрепления препарата. Тубусодержатель поднимается и опускается с помощью макрометрического и микрометрического ви н т о в, предназначенных для грубой и точной фокусировки объекта. Поворот макрометрического винта на один оборот поднимает или опускает тубусодержатель на 2 мм, микрометрического — на 0,1 мм. Вверху прямого или наклоного тубуса, на котором крепится револьвер, куда ввинчиваются 2—4 объектива. Замена объективов производится при повороте револьвера вокруг оси.

Оптическая часть микроскопов состоит из осветительного аппарата, объективов и окуляров. Осветительный аппарат (рис. ) располо­жен под предметным столиком и состоит из зеркала, конденсора и ирис-диафрагмы. Зеркало имеет две поверхности: плоскую и вогнутую; оно отражает световые лучи и направляет их к конденсору. При естественном освещении при больших увеличениях употребляется плоское зеркало, при искусственном, как и при естественном при малых увеличениях (без конденсора),— вогнутое. Конденсор представляет собой систему сильных линз и служит для усиления яркости освещения рассматриваемого объекта. Собирая лучи света, отраженные зеркалом, конденсор концентрирует их в плоскости препарата. Передвигается конденсор в вертикальном направлении при помощи винта. При опускании конденсора - поле зрения микроскопа затемняется, при поднятии — освещается. При слишком сильном освещении для зрения конденсор рекомендуется опустить, а при слабом — поднять.

Ирис-диафрагма, расположенная под кон­денсором, состоит из тонких металлических сегмен­тов, которые при помощи рычажка можно сдвигать или раздвигать, регулируя этим поступление света в конденсор.

Объективы являются наиболее ценной частью микроскопа. Они ввинчиваются в гнезда револьвера и состоят из системы линз, заключенных в металли­ческую оправу. Передняя, или фронтальная, линза объ­ектива является самой маленькой и единственной, дающей увеличение. Остальные линзы в объективе толь­ко исправляют недостатки полученного изображения и называются коррекционными. В сильных объективах фронтальные линзы имеют наибольшую кривизну при наименьшем диаметре, приближаясь к форме полушара. Все объективы делятся на ахроматы — более простые и апохроматы — более совершенные, на­иболее полно устраняющие недостатки оптического изображения.

Рис 3. Устройство и оптическая схема микроскопа МБР-1:

1 — башмак микроскопа; 2 — кронштейн конденсора; 3 — тубусодержатель (ручка микроскопа); 4 — коробка с микромеханизмом; 5 — окуляр; 6 — тубус; 7 — призма; 8 — головка тубусодержателя; 9 — винт для фиксации револьвера; 10 — револьвер на салазках; 11 — объектив; 12 — предметный столик; 13 - конденсор; 14 — рукоятка ирис-диафрагмы; 15—диафрагма; 16 — зеркало; 17 — микрометрический винт; 18 — макрометрический винт

Кроме того, объективы делятся на сухие и иммерси­онные. Сухими называются объективы, при работе с которыми между фронтальной линзой и рассматрива­емым предметом находится слой воздуха. Иммерси­онными (от лат. immersio — погружаю) называются объективы, фронтальная линза которых при работе погружается в нанесенную на препарат каплю жидкости с показателем преломления, близким к показателю пре­ломления стекла. Лучшим для этой цели является кед­ровое масло с коэффициентом преломления 1, 515 (ко­эффициент преломления стекла 1,53). Световые лучи при переходе из стекла в слой кедрового масла не пре­ломляются и, не отражаясь, попадают в объектив. Та­ким образом достигается наилучшее освещение рассмат­риваемого предмета.

Рис. 4. Ход лучей при наличии между объективом и покровным стеклом воздуха, воды и иммерсионного масла:

О — предметное стекло; d — покровное стекло; Р — препарат; f — передняя линза объектива; n — показатель преломления среды; АВ — оптический раз­рез; а — сухой объектив; 6 — водная иммерсия; s — масляная иммерсия.

Рис.5. Соотношение между увеличением объектива, рабочим расстоянием объектива и степенью раскрытия ирисовой диафраг­мы конденсора

Биологические микроскопы МБР-1 и МБИ-1 обычно имеют 3—4 объектива с цифровыми обозначениями 10 (или 8), 20, 40, 60 и 90Х (иммерсионный), показываю­щими собственное увеличение этих объективов. Наибо­лее сильными объективами микроскопов являются объективы 90, 100, 101 и 110Х.

Окуляр (от лат. oculus — глаз) вставляется в верхний конец тубуса. Окуляр представляет собой сис­тему двух плоско-выпуклых линз, обращенных выпук­лостью в сторону объектива. Линза, обращенная к глазу, называется глазной, а обращенная к препарату,— собирающей. У окуляров с большим увеличением фокус короче, поэтому меньше и длина окуляра. Между линзами имеется диафрагма, ограничивающая поле зрения и задерживающая кривые лучи света. Окуляры поме­чаются цифрами, показывающими их собственное уве­личение: 5, 7, 10, 15х. При работе с апохроматами при­меняются более сложные компенсационные окуляры, устраняющие оптические недостатки объективов.

Наиболее четкое изображение предмета получается при сочетании сильных объектов со слабыми и средни­ми окулярами. Для того чтобы определить увеличение данной системы микроскопов, следует умножить пока­затель увеличения объектива на показатель увеличе­ния окуляра. Например, при окуляре 7х и объективе 90х увеличение микроскопа равно 630.

Действительное изображение предмета дает объек­тив. Окуляр же только увеличивает изображение, дан­ное объективом и, не прибавляя ничего нового, дает уве­личенное обратное и мнимое изображение рассматри­ваемого объекта.

Осветитель. При микроскопии часто применя­ется электрический свет. Во многих микро­скопах (МБИ-2, МБИ-6) осветительное устройство вмонтировано в основание микроскопа. В микроскопе МБР-1 такое приспособление не предусмотрено и для работы пользуются специальными осветителями ОИ-7, ОИ-19 и др.

Рис.6. Осветитель ОИ-19 с микроскопом:

1 — штатив осветителя; 2 — корпус осветителя; 3 — патрон с лампой; 4 — рукоятка ирисовой диафрагмы; 5—светофильтр; 6 — трансформатор; 7—рукоятка реостата; 8 — выключатель; 9 — соединительная планка

Рис. 7. Бинокулярная насадка АУ-12, установленная на микроскопе: 1,2 - окулярные трубки; 3 — диоптропный механизм; 4 — кольцо диоптропного механизма; 5 —шаровидный корпус с трубчатой осью и устано­вочным фланцем

Для изучения колоний микроорганизмов, растущих на плотных питательных средах, и особенно для продолжи­тельного микроскопирования препаратов микробов поль­зуются бинокулярным микроскопом или бинокулярной насадкой (рис. 8) , позволяющими получать стереоско­пическое изображение предмета в трех измерениях не так быстро утомляющими зрение. При этом положе­ние трубок с окулярами регулируют до тех пор, пока изображение не совпадет в одном поле зрения.

Установка света по Кёлеру

Хорошие результаты при работе с микроскопом могут быть получены только при условии правильного освещения объекта. Лучший способ освещения основан на системе Кёлера. Установку света выполняют в такой последовательности.

1. Предварительная подготовка:

• ставят микроскоп и осветитель на крестовину, что обеспечи­вает необходимое расстояние между источником света и зеркалом микроскопа;

• на предметный столик помещают препарат «раздавленная капля» или фиксированный окрашенный препарат;

• устанавливают объектив 8х;

• поднимают конденсор вверх до упора так, чтобы верхняя линза конденсора находилась в одной плоскости с предметным столиком микроскопа; ,

• открывают полностью диафрагму конденсора;

• отодвигают матовое стекло;

• ставят плоское зеркало;

• закрывают почти полностью диафрагму осветителя, оставив только небольшое отверстие.

2. Включают осветитель и придают его корпусу такое положение, при котором свет падал бы в центр поля зрения.

3. Кладут на зеркало микроскопа кружок белой бумаги и, передвигая патрон лампы осветителя вдоль корпуса, фокусируют на бумагу изображение витка нити лампы осветителя. Пользуясь ре­остатом, уменьшают яркость лампы осветителя, чтобы при дальнейшей работе не повредить глаза.

4. Глядя в окуляр и поворачивая зеркало, находят в поле зре­ния изображение краев диафрагмы осветителя, которое имеет вид светлого пятна с нечеткими краями. Величина пятна зависит от степени раскрытия диафрагмы осветителя и положения объектива. Чем шире открыта диафрагма и чем выше объектив, тем больше пятно (рис.9).

5. Если оно занимает значительную часть поля зрения, уменьшают его, несколько опустив объектив или сузив отверстие диафрагмы осветителя, гля­дя при этом в окуляр. В тех случаях, когда пят­но сдвинуто к краю поля зрения, его переводят в центр осторожным поворотом зеркала. По ря­ду причин (отсутствие точечного источника света, аберрация) под микроскопом чаще всего видно не одно пятно, а несколько четких пятен (рис.10). Установку света осу­ществляют по центральному пятну.

6. Используя объектив 8х, фокусируют объект в области светлого пятна.

7. Глядя в окуляр и слегка опуская конденсор, фокусируют в плоскости препарата изображение краев диафрагмы осветителя, т. е. получают изображение светлого пятна с четко очерченными краями.

8. С помощью зеркала переводят яркое пят­но в центр поля зрения. Если пятно освещено неравномерно, добиваются его равномерного ос­вещения, слегка поворачивая корпус осветителя. При необходимости пятно снова центрируют.

9. Открывают диафрагму осветителя не более чем на 2/3.

10. Устанавливают объектив 40х (для препарата «раздавлен­ная капля») или 90х (для фиксированного окрашенного препара­та, на который предварительно наносят иммерсионное масло) и фокусируют объект.

Рис.8. Не центрированное изображение отверстия диа­фрагмы осветителя при высоко поднятом объективе 8х

Рис.9. Центрированное изображение отверстия диафраг­мы осветителя при низко опущенном объективе 8х

Яркость освещения регулируют изменением с помощью рео­стата накала лампы осветителя или применением светофильтров. Положение зеркала, конденсора и диафрагмы осветителя менять нельзя! Диафрагмой конденсора пользуются только для увеличе­ния контрастности (четкости) изображения, когда работают с объективом 40х. Апертура не иммергированного конденсора близка к 1, а числовая апертура объектива 40х составляет 0,65. Чтобы привести в соответствие апертуру конденсо­ра с апертурой объектива, поступают следующим образом. Уста­новив свет по Кёлеру и сфокусировав препарат с объективом 40х, вынимают окуляр и, глядя в тубус, прикрывают диафрагму конден­сора до тех пор, пока края диафрагмы не станут видны у границы равномерно освещенной верхней линзы объектива. При работе с объективом 90х диафрагму конденсора оставляют открытой, по­скольку числовая апертура этого объектива 1,25.

Правила работы с иммерсионным объективом

Устанавливают свет по Кёлеру. На сухой фиксированный ок­рашенный препарат наносят каплю иммерсионного масла. Уста­навливают объектив 90х и, глядя сбоку, осторожно опускают макрометрическим винтом тубус микроскопа до погружения объекти­ва в масло. Следят за тем, чтобы фронтальная линза объектива не коснулась предметного стекла. (Фронтальная линза высокоапертурных иммерсионных объективов при грубом обращении может легко сместиться.) Затем, наблюдая в окуляр, макровинтом мед­ленно поднимают тубус и фокусируют объект. Тонкую фокусировку осуществляют с помощью микрометрического винта.

По окончании микроскопирования поднимают тубус, снимают препарат и осторожно протирают фронтальную линзу объектива сначала сухой хлопчатобумажной салфеткой, а затем той же сал­феткой, но слегка смоченной очищенным бензином. Нельзя остав­лять масло на поверхности линзы, так как на нем собирается пыль, что может привести к повреждению объектива. Препарат освобож­дают от масла сначала кусочком фильтровальной бумаги, а затем обрабатывают стекло бензином или ксилолом.

Кедровое масло и очищенный бензин обычно сохраняют в мас­ленках, которые представляют собой два флакона, вставленных один в другой. Во внутренний флакон наливают кедровое масло, в наружный — очищенный бензин. Флакон с маслом закрывают пробкой, в которую вставлена стеклянная палочка. Этой палочкой наносят масло на препарат.

Рис.11. Микрофлора зубного налета при микроскопии в светлом поле

МИКРОСКОПИЯ В ТЕМНОМ ПОЛЕ

Темнопольная микроскопия основана на способности микроорганизмов сильно рассеивать свет. Объект освещается косыми боковыми лучами и в объектив микроскопа попадают только лучи, рассеянные частицами, находящимися в препарате. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля, известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. Чтобы в объектив не попадали прямые лучи от осветителя, апертура объектива должна быть меньше, чем апертура конденсора. Для уменьшения апертуры в обычный объектив помещают диафрагму или пользуются специальными объективами, снабженными ирисовой диафрагмой.

При темнопольной микроскопии микроорганизмы выглядят ярко светящимися на черном фоне. При этом способе микроскопии могут быть обнаружены мельчайшие микроорганизмы, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности микроскопа. Однако темнопольная микроскопия позволяет увидеть только контуры объекта, но не дает возможности изучить внутреннюю структуру. С помощью темнопольной микроскопии изучают препараты типа раздавленная "капля". Предметные стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные 0,17 мм, без царапин и загрязнений.

При приготовлении препарата следует избегать наличия пузырьков и крупных частиц (эти дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат). Для темнопольной применяют более мощные осветители и максимальный накал лампы.

При таком освещении лучи не попадают в объектив и остаются невидимыми для глаза, поэтому поле зрения выглядит совершенно черным. Если препарат содержит какие-то частицы, например микроорганизмы, то косые лучи в определенной степени отражаются от их поверхности, отклоняются от своего первоначального направления и попадают в объектив. В этом слу­чае наблюдатель видит на интенсивно черном фоне ослепительно яркие, светящиеся объекты. Такое освещение препарата достигает­ся применением специального темнопольного конденсора, которым заменяют обычный конденсор микроскопа. Основная особенность темнопольных конденсоров заключается в том, что центральная часть у них затемнена и прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не попадают. (Темнопольный конденсор имеет затемненную среднюю часть, поэтому централь­ные лучи света, идущие от зеркала, задерживаются, а в плоскость препарата попадают только боковые лучи, отраженные от зеркаль­ных поверхностей, расположенных внутри конденсора). При микроскопировании в темном поле можно увидеть объек­ты, величина которых измеряется сотыми долями микрометра, т. е. лежит за пределами видимости обычного микроскопа. Однако на­блюдение объектов в темном поле позволяет различать только их контуры, но не дает возможности рассмотреть внутреннее строение.

Микробы при этом начина­ют светиться подобно тому, как невидимые в воздухе мель­чайшие частицы пыли становя­тся видимыми в темном поме­щении при освещении пучком световых лучей, пропущенным через узкую щель.

Конденсор темного поля (рис. 12) состоит из наружного корпуса, в котором расположе­на рамка. К рамке прикре­плен внутренний патрон с оптической частью, состоящей из линзы (кардиоид), за­щитного стекла и кольцевой диафрагмы. Рамка с оп­тической частью перемещается в плоскости, перпенди­кулярной оси, с помощью двух регулировочных винтов. Для получения отчетливого изображения перед нача­лом работы производят центрировку, т. е. совмещение оптической оси микроскопа с осью конденсора. Пра­вильность центрировки узнают по светлому, интенсивно и равномерно освещенному кольцу, видимому в окуля­ре, которое должно быть расположено в центре ноля зрения.

Просмотр препарата с конденсором темного поля производится с сухими и иммерсионными системами объективов. Иммерсионное масло без пузырьков возду­ха наносят между верхней поверхностью конденсора и предметным стеклом; если объектив иммерсионный, мас­ло наносят на покровное стекло. При работе с иммерсионным объективом 90 применяют специальную диаф­рагму, которая прилагается к конденсору темного поля. Толщина предметных стекол не должна превышать 0,8—1,2 мм, покровных—0,2 мм. Стекла должны быть безукоризненно чистыми и прозрачными, без царапин.

Работу проводят при прямом солнечном или электри­ческом освещении. В последнем случае используется специальная осветительная установка с лампой в 100— 150 Вт.

Рис.12. Конденсор темного поля ОИ-13

Рис. 13. Ход лучей в темном поле зрения:

О — объектив, П — препарат, ВИ — водная иммерсия, ЛК — линза конденсора, ДТ — диаф­рагма темного поля, ПС — пред­метное стекло

Техника микроскопии. Устанавливают и центрируют освещение по светлому полю. Заменяют конденсор со светлым полем на темнопольный конденсор. Для той же цели можно переделать обыч­ный конденсор. Для этого необходимо отвинтить верхнюю линзу конденсора, положить на центральную часть нижней линзы кружок из черной бумаги (закрыть примерно ²/з линзы), привинтить верхнюю линзу. Ставят конденсор в держа­тель и закрепляют вин­том. Открывают полно­стью диафрагму освети­теля, обеспечивая макси­мальную силу света вы­ключением реостата. На верхнюю линзу приспу­ щенного конденсора на­носят каплю иммерсион­ной жидкости (кедровое масло, смесь вазелиново­го масла и бромнафтали-на, дистиллированной во­ды, что проще и доступ­нее). Жидкость не долж­на содержать пузырьков воздуха. Для исследования в темном поле препарат готовят по методу раздав­ленной капли. Небольшую каплю исследуемого матери­ала наносят на предметное стекло. Каплю накрывают тонким (не более 0,17 мм) покровным стеклом так, что­бы под ним не оказалось пузырьков воздуха. Толщина предметного стекла должна быть не более 1,1 мм, так как в противном случае фокус конденсора (точка пере­сечения высокоапертурных лучей) будет находиться в толще стекла, а не в плоскости препарата и иссле­дователь не получит эффекта темного поля.

Помещают препарат на предметный столик микро­скопа. Приподнимают конденсор до тех пор, пока иммерсионная жидкость распространится по нижней поверхности предметного стекла. Револьвером устанав­ливают малое увеличение и фокусируют микроскоп на препарат. При правильной центрировке конденсора к оптической оси объектива в поле зрения должно быть светлое пятно или светлое пятно с темным центром и светящиеся подвижные точки бактерий или других частичек, содержащихся в препарате. Регулировочным винтом конденсора центрируют светлое пятно на сере­дину поля зрения, а интенсивность его видимости регу­лируют подъемом или опусканием конденсора. После этого револьвером устанавливают объектив с нужным увеличением (обычно Х40), дополнительно центрируют конденсор и зеркало.

Микроскопия в темном поле зрения применяется для наблюдения за подвижностью микробов, обнаружения возбудителей некоторых болезней (лептоспир) и изу­чения таких микробов, величина которых находится на грани разрешающей способности светлопольной микро­скопии. В темном поле зрения можно изучить влияние различных воздействий на клетку, наблюдать за изме­нением степени дисперсности коллоидов протопласта и их коагуляцией. В неповрежденной живой клетке протоплазма бывает гомогенной. В результате гибели или повреждения клетки ее содержимое начинает ярко светиться. Однако в темном поле зрения нельзя хорошо изучить форму и тем более внутреннее строение микро­бов.

Порядок работы с темнопольным конденсором

1. Препарат «раздавленная капля», приготовленный на тонком и тщательно очищенном предметном стекле, помещают на столик микроскопа и фокусируют с объективом 8Х. После этого поло­жение тубуса не меняют до фокусировки препарата с объективом 40Х.

2. Вынимают светлопольный конденсор, окуляр и вывинчива­ют один из объективов. Если револьвер микроскопа имеет одно свободное от объектива отверстие, закрытое специальной заглуш­кой, можно воспользоваться этим отверстием, вывинтив заглушку. Устанавливают свободное от объектива отверстие над препаратом.

3. Закрыв диафрагму осветителя почти до предела, фокуси­руют изображение нити лампы на зеркале, прикрытом кружком белой бумаги (как при установке света по Кёлеру). Уменьшают яркость света с помощью реостата.

4. Открывают диафрагму осветителя. Прикрыв верхний конецтубуса микроскопа матовым стеклом и слегка поворачивая зерка­ло, добиваются равномерного освещения поля. После этого зеркало перемещать нельзя!

5. Вставляют окуляр, устанавливают объектив 8Х и осторож­но, не задевая зеркала,устанавливают темнопольный конденсор.

6. Последний вставляют так, чтобы белый винт был обращен в сторону штатива микроскопа, а два регулировочных винта — в сторону осветителя. Надевают на регулировочные винты ключи. Если при установке темнопольного конденсора произошло хотя бы не­большое изменение положения зеркала, вынимают конденсор и вновь регулируют освещение.

7. Препарат сдвигают в сторону, на верхнюю линзу конденсора наносят иммерсионное масло и, несколько опустив конденсор, снова устанавливают препарат, закрепив его клеммами.

8. Поднимают конденсор вверх до упора. Масло должно равномерно заполнить пространство между линзой конденсора ипредметным стеклом и не содержать пузырьков воздуха. В противном случае операцию следует повторить, увеличив масляную каплю.

9. Отключают реостат осветителя, т. е. получают максимальное освещение.

10. Глядя в окуляр, центрируют конденсор. Для этого с помощью регулировочных винтов приводят точно в центр поля зрения изображение светлого кольца с темным пятном в середине или только светлого пятна. Кольцо или пятно отличаются от ярких, четко очерченных пузырьков воздуха белесоватым оттенком и «размытостью» — отсутствием четких границ.

11. Если при центрировке обнаружено светлое кольцо, то, наблюдая в окуляр и слегка поднимая или опуская конденсор, уста­навливают последний в таком положении, чтобы в поле зрения исчезло темное пятно и вместо кольца осталось только замкнутое светлое пятно. Если при центрировке выявлено светлое пятно, конденсор не перемещают.

12. Ставят объектив 40Х и фокусируют препарат.

Для получения лучшего эффекта применяют зеленый фильтр. При смене препарата или объектива тщатель­но проверяют центрировку кольцевой диафрагмы с фа­зовой пластинки. Фазово-контрастный конденсор мож­но оставлять на штативе, так как для перехода к на­блюдению в светлом поле нужно лишь перевести ре­вольвер конденсора в нулевое положение.

Рис.14 Лептоспира в темном поле (микрофотография)

Рис.15. Бактерии из зубного на­лета в темном поле зрения

Фазово-контрастная микроскопия

Фазово-контрастная микроскопия позволяет получать контрастные изо­бражения неокрашенных, неконтрастных объектов, в которых темные и светлые места соответствуют различ­ной толщине и оптической плотности препарата.

Известно, что контрастность изображения находится в прямой зависимости от степени поглощения света различными структурными элементами объекта. Если в объекте чередуются места, сильно и слабо адсорби­рующие свет, то последний, проходя через объект, из­меняет свою амплитуду. Интенсивность световых лучей, прошедших через различные участки такого объекта, будет различной. Такие препараты называются ампли­тудными. Наряду с амплитудными существуют совершенно прозрачные объекты. Пройдя через такие объекты, свет или совсем не ослабляется, или ослабляется чрезвы­чайно мало. Однако в зависимости от различных пока­зателей преломления отдельными участками объекта или его неравномерной толщины по выходе из объекта смещается фаза светового колебания. Сдвиг фазы про­исходит из-за неодинаковой скорости распространения света в средах с различной оптической плотностью. В местах большей оптической плотности свет как бы замедляет свою скорость, изменяется по фазе. Такие объекты называются фазовыми. К ним относится большинство живых клеток и микроорганизмов. Глаз человека и фотопластинка фазовые колебания света не выявляют. Для их обнаружения служит метод фазовых контрас­тов, предложенный в 1934 г. голландцем Цернике.

Метод фазовых конт­растов основан на ис­пользовании теории Аббе о дифракционном по­строении изображения в микроскопе/

Сущность метода сво­дится к тому, что обыч­ный конденсор микроско­па заменяют на специальный конденсор с коль­цевой диафрагмой, а в револьвер ввинчивают специальный объектив. На полевую линзу этого объектива нанесена фазовая пластинка в виде кольца, состоящая из тонкого слоя специ­ального состава. Кольцо света, проходя через кольцевую диафрагму конденсора и объект, фокусируется на фазовой пластинке объ­ектива. Фазовая пластинка значительно ослабляет силу света нулевого максимума и смещает фазы проходящих через него прямых световых волн на 90°.

Луч света, падающий на прозрачный объект, рас­щепляется на два луча — прямой и дифрагированный. Прямой луч (рис. , А) идет из кольцевой диафрагмы, проходит через частицу объекта и фокусируется на кольце фазовой пластинки. Дифрагированный луч, (рис. , Б), проходя через объект, не попадает на фа­зовую пластинку. Оптические пути этих двух лучей оказываются различными. Между ними создается раз­ность фаз, и невооруженным глазом нельзя уловить это смещение фаз. Однако фазовой пластинкой эти фазо­вые изменения преобразуются в амплитудные, воспри­нимаемые глазом изменения. Прозрачные в светлом поле зрения препараты становятся резко контрастными на светлом фоне (положительный фазовый контраст) или блестящими на темном фоне (отрицательный фа­зовый контраст).

Рис.16. Ход лучей в фазово-контрастном микроскопе:

А — прямой и В — дифрагирован­ный лучи

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из: 1) набора объективов-ахроматов. В каждом объективе имеется фазовая пластинка в виде темного кольца, нанесенного на внутреннюю линзу. Назначение пластинки состоит в изменении фазы нулевого максимума на 90° и уменьшении его интенсивности; 2) фазово-контрастного конденсора и револьвера с набором кольцевых диафрагм, которые ус­танавливают применительно к каждому объективу. Для наблюдения обычным способом в конденсоре имеется ирис-диафрагма, а в диске револьвера — отверстие для пропуска световых лучей. Смена кольцевых диафрагм перед объективом производится поворотом револьвера до фиксации. Для центрировки кольцевой диафрагмы относительно фазовой пластинки объектива служат два боковых винта; 3) вспомогательного микроскопа, встав­ляемого в тубус вместо окуляра и служащего для наблюдения при центрировке кольцевой диафрагмы по отношению к фазовой пластинке.

Рис.17. Приспособление для фазово-контраст­ной микроскопии:

ВМ — вспомогательный микроскоп, КФ — конден­сор фазовый, ОФ — объективы фазовые

Настройку микроскопа с фазово-контрастной при­ставкой производят следующим образом:

1. Заменяют объективы и обычный конденсор в мик­роскопе на фазовые.

2. 2. Поворотом диска конденсора устанавливают ну­левую диафрагму (в окошечке должна появиться цифра 0).

3. Помещают препарат на столик микроскопа, при объективе ХЮ уста­навливают освещение и производят фокусировку. Диафрагму конденсора открывают полностью.

4. Заменяют нулевую диафрагму конденсора на диафрагму, соответствую­щую увеличению используемо­го фазового объектива. Так, при рассматривании пре­парата с объективом ХЮ повернуть ре­вольвер конденсора до появления в окошечке цифры 10.

5. Заменяют окуляр микроскопа на вспомогательный микроскоп. Ослабив винт, осторожно поднимают выдвижную трубу вспомога­тельного микроскопа до по­явления отчетливого изображения коль­цевой диафрагмы конденсора и фазовой пластинки объектива.

6. Фиксируют выдвижную трубу вспомогательного микроскопа вин­том.

7. Вращением центрировочных винтов конденсора совмещают коль­цевую диафрагму конденсора с фазовым кольцом объектива.

8. Вынимают вспомогательный микроскоп из тубу­са, вставляют нуж­ный окуляр, устанавливают фокус и изучают объект.

При каждой смене объективов необходимо повторить все операции, указанные в пунктах 4, 5, 6, 7, 8.

Рис.18.Фазово-контрастная микроскопия Bacillus cereus на плотной питательной среде (в камере М. А. Пешкова)

Фазово-контрастная микроскопия не увеличивает разрешающей способности оптической системы микро­скопа. Однако она позволяет видеть тонкие детали структуры живых микробов, изучить стадии их развития и процесс деления, выявить влияние химических ве­ществ, антибиотиков и других факторов на микробную клетку, измерить ее прижизненную величину. Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

ДИК (дифференциально-интерференционный контраст) - является прекрасным механизмом для создания контраста в прозрачных препаратах. Микроскопия с ДИК представляет собой интерференционную систему с расщеплением пучка света, при которой контрольный пучок отклоняется на небольшое расстояние, обычно меньшее, чем диаметр дифракционного кружка. С помощью данного метода получается монохроматическое оттененное изображение, которое отображает градиент оптических путей как высоко-, так и низкопространственных частот, присутствующих в препарате. Те участки препарата, при прохождении через которые оптические пути удлиняются по отношению к контрольному пучку, выглядят ярче или темнее, тогда как участки, между которыми различия меньше, обладают противоположным контрастом. Чем круче становится градиент оптических пучков, тем резче контраст изображения.

Хоффмановский контраст (ХК) представляет собой метод косого освещения, повышающий контраст в окрашенных и неокрашенных препаратах за счет образования градиента оптических фаз. ХК пoзвoляeт нaблюдaть тpexмepнoe изoбpaжeниe живыx oбpaзцoв в плacтикoвыx чaшкax c выcoкoй чeткocтью. За счет использования бoльшиих paбoчих paccтoяний и выcoких чиcлoвых aпepтуp метод позволяет тoчнo oтcлeживaть движeние в пoлe зpeния, нaпpимep, пpи проведении микроманипуляций.

ХК мoжeт быть пpимeнeн нa микpocкoпe c флуopecцeнтным ocвeтитeлeм. Изучeниe мopфoлoгии c пpимeнeниeм флуopecцeнции или бeз тaкoвoй вoзмoжнo бeз cмeны oбъeктивoв и oбpaзцa. Стоит отметить преимущество Хоффмановского контраста по сравнению с Фазовым контрастом. Известно, что Фaзoвoму кoнтpacту пpиcущ эффeкт Гaлo - появление светящегося ореола по контуру изображения объекта. B peзультaтe Bы мoжeтe пoтepять вaжную инфopмaцию. XК нe дaeт Гaлo, чтo пoзвoляeт лeгкo oпpeдeлять cвoйcтвa кpaeвыx cтpуктуp, нaпpимep, тoчнo зaмepять углы или расстояния.

Рис.19.Хоффмановский контраст