
- •Раздел 1 систематика микроорганизмов
- •Раздел 2
- •Морфология и ультраструктура микроорганизмов
- •Лабораторное занятие №1
- •Микроскопические методы исследования в микробиологии
- •1. Техника безопасности работы в учебной лаборатории
- •Светлопольная микроскопия
- •Люминесцентная микроскопия
- •Электронная микроскопия.
- •Каждый студент отрабатывает технику микроскопии
- •1. Техника безопасности работы в учебной лаборатории
- •Проведение занятия
- •Проведение занятия
- •Проведение занятия
- •Раздел 3 физиология и биохимия микроорганизмов
- •Питательные среды
- •Культивирование микроорганизмов
- •1.Посев штрихом или разливом на твердую среду
- •Проведение занятия
- •Дезинфекция, асептика, антисептика
- •Стерилизация питательных сред
- •Культивирование микроорганизмов в лабораторных условиях
- •Посев инокулята
- •Особенности культивирования облигатно-анаэробных бактерий
- •Физические методы
- •Химические методы
- •Биологические методы
- •Методы выделения чистых культур облигатных анаэробов
- •Питательные среды для идентификации анаэробов
- •Проведение занятия
- •III этап выделения чистой культуры аэробных бактерий
- •I этап выделения чистой культуры анаэробных бактерий
- •Проведение занятия
- •II этап выделения чистой культуры анаэробных бактерий
- •III этап выделения чистой культуры анаэробных бактерий
- •Раздел 4
- •Цель : ознакомление с методами генной инженерии и трансформацией плазмидной днк
- •Трансформация с применением хлористого кальция
- •Записать в тетрадях методику трансформации e.Coli с применением кальция
- •Записать состав среды lb и метод приготовления селективной среды с тетрациклином.
- •Раздел 5 Инфекция и молекулярно-генетические основы вирулентности микробов
- •Применение лабораторных животных для биологических методов исследования
- •Способы заражения
- •Вскрытие животных
- •Раздел 6 распространение микроорганизмов в природе и микрофлора тела человека. Санитарная микробиология
- •Ознакомиться с методами санитарной микробиологии
- •Определить общее микробное число воды и воздуха
- •Раздел 7 Основы химиопрофилактики и химиотерапии
- •Приготовление инокулюма из агаровой культуры
- •Приготовление инокулюма из бульонной культуры
- •Литература
- •Содержание
Трансформация с применением хлористого кальция
Этот способ трансформации бактерий плазмидной ДНК применяется наиболее часто (Mandel, Hida, 1970). Выход трансформантов составляет 105-107 на 1 мкг интактной ДНК рВR322 при использования штамма Е. coli НВ101.
1. Внесите в 500-мл колбу 100 мл бульона L и 1 мл ночной культуры бактерий. Выращивайте клетки при 37 °С с интен- сивным перемешиванием до плотности 5107 клетка/мл. Обычно это занимает 2—4 ч. Для одной пробы на трансформа- цию требуется 3 мл клеток.
Примечание. Соотношение между оптической плотностью и числом жизнеспособных бактерий в 1 мл культуры варьирует от штамма к штамму. Например, для штаммов rес+(1776, ММ284) концентрации 5107 клетка/мл соответствует D550 = = 0,2, а для штаммов rec- (DH1, НВ101) концентрации 5107 клетка/мл соответствует D550 = 0,5. Калибровочную кривую зависимости d550 от числа бактерий в 1 мл культуры следует строить для каждого нового штамма Е. соli, применяемого в работе.
Охладите культуру во льду (10 мин). Отцентрифугируй- те суспензию клеток при 4000 g в течение 5 мин при 4°С.
Удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клет- ки в половине начального объема охлажденного во льду сте- рильного раствора 50 мМ СаСl2+10 мМ трис-HCI, рН 8,0.
Поместите суспензию клеток в ледяную баню на 15 мин, а затем отцентрифугируйте суспензию при 4000 g в течение 5 мин при 4°С.
Удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клет- ки в 1/15 начального объема охлажденного во льду стериль- ного раствора 50 мМ СаС12+10мМ трис-HCl, рН 8,0. Распре- делите аликвоты объемом 0,2 мл по предварительно охлаж- денным пробиркам. Клетки можно хранить при 4°С 12-24 ч.
Примечание. Для максимальной эффективности трансформации очень важно, 1) чтобы бактерии находились в логарифмической фазе роста и чтобы во время обработки хлористым кальцием плотность суспензии была низкой; 2) чтобы клетки выдерживались при 4°С 12—24 ч. За это время эффективность трансформации возрастает в 4—6 раз (Dagert, Ehrlich, 1979). Через 48 ч она снизится до первоначального уровня.
Добавьте ДНК в буфере, применяемом для реакции с ли- газами (лигазный буфер), или в буфере ТЕ. Размешайте и ин кубируйте смесь во льду 30 мин. Для каждой пробы можно брать до 40 нг ДНК (соответственно 100 мкл лигазного 6уфе- ра или буфера ТЕ). Увеличение количества ДНК или объема буфера приводит к снижению эффективности трансформации
Перенесите пробы в водяную баню (42°С) на 2 мин
Добавьте в каждую пробирку по 1,0 мл бульона L и ин- кубируйте 30 мин при 37 °С (при тетрациклиновой селекции) или 1 ч (при ампициллиновой или канамициновой селекции) без качания. За это время в бактериях пройдет процесс вос- становления и начнется экспрессия генов устойчивости к анти- биотикам.
Высейте удобное количество клеток на плотную селектив- ную среду, используя методику растирания (распределения клеток шпателем) или методику верхнего агара*. В пос- леднем случае трансформантов получается несколько больше.
Если селекцию ведут на устойчивость к тетрациклину, то трансформационную смесь можно целиком высеять в одну чашку. При селекции на устойчивость к ампициллину в чашку следует высевать только часть культуры (найденную эмпирически), так как число вырастающих трансформантов увеличивается не пропорционально высеваемому объему, возможно, из-за накопления в среде токсичных веществ, выделяемых убитыми антибиотиком клетками. Кроме того, при селекции на устойчивость к ампициллину плотность высеваемой суспензии должна быть низкой, а чашки нужно перенести через 16—24 ч; из термостата в холодильник (4°С). Дело в том, что ампициллин разрушается -лактамазой, секретируемой устойчивыми трансформантами, поэтому при густом засеве или длительной инкубации вокруг колоний трансформантов вырастут сателлитные колонии, сформированные чувствительными к антибиотику клетками.
10. Оставьте чашки при комнатной температуре, пока не затвердеет верхний агар или не впитается жидкость.
11. Переверните чашки и инкубируйте их при 37 оС. Колонии должны появиться через 12—16 ч.
Приготовление плотной селективной среды с тетрациклином.
Приготовьте раствор тетрациклингидрохлорида с концентрацией 12,5 мг/мл в смеси этанол – вода (50% по объему). Простерилизуйте его фильтрованием и храните порциями при –20 оС в темноте (например, во флаконах, обернутых алюминиевой фольгой).
Для чашек. После автоклавирования охладите среду до 55 оС и добавьте тетрациклин до конечной концентрации 12,5 – 15,0 мкг/мл. Так как тетрациклин разрушается на свету, чашки следует хранить при температуре 4 оС в темноте.
Примечание. Ионы магния являются антагонистами тетрациклина. Поэтому для выращивания бактерий в присутствии этого антибиотика лучше использовать среды без солей магния (например, среду LB). Если нужна более богатая среда, то можно использовать среду 1776, в которую вместо хлористого магния добавлен хлористый натрий (6 г/л).
Среда LB (Лурия-Бертани)
На 1 л: Триптон 10 г
Дрожжевой экстракт 5 г
Na Cl 10 г
Довести рН до 7,5 с помощью NaOH
Агар Bacto 15 г
Проавтоклавировать и разлить по чашкам.
Задание: