Трансформация с применением хлористого кальция

Этот способ трансформации бактерий плазмидной ДНК при­меняется наиболее часто (Mandel, Hida, 1970). Выход транс­формантов составляет 10⁵-10⁷ на 1 мкг интактной ДНК рВR322 при использования штамма Е. coli НВ101.

1. Внесите в 500-мл колбу 100 мл бульона L и 1 мл ночной культуры бактерий. Выращивайте клетки при 37 °С с интен-­ сивным перемешиванием до плотности 510⁷ клетка/мл. Обычно это занимает 2—4 ч. Для одной пробы на трансформа-­ цию требуется 3 мл клеток.

Примечание. Соотношение между оптической плотностью и числом жизнеспособных бактерий в 1 мл культуры варьирует от штамма к штамму. Например, для штаммов rес+(1776, ММ284) концентрации 510⁷ клетка/мл соответствует D₅₅₀ = = 0,2, а для штаммов rec- (DH1, НВ101) концентрации 510⁷ клетка/мл соответствует D₅₅₀ = 0,5. Калибровочную кривую за­висимости d₅₅₀ от числа бактерий в 1 мл культуры следует строить для каждого нового штамма Е. соli, применяемого в работе.

2. Охладите культуру во льду (10 мин). Отцентрифугируй- те суспензию клеток при 4000 g в течение 5 мин при 4°С.

3. Удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клет- ки в половине начального объема охлажденного во льду сте-­ рильного раствора 50 мМ СаСl₂+10 мМ трис-HCI, рН 8,0.

4. Поместите суспензию клеток в ледяную баню на 15 мин, а затем отцентрифугируйте суспензию при 4000 g в течение 5 мин при 4°С.

5. Удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клет-­ ки в 1/15 начального объема охлажденного во льду стериль-­ ного раствора 50 мМ СаС1₂+10мМ трис-HCl, рН 8,0. Распре-­ делите аликвоты объемом 0,2 мл по предварительно охлаж­- денным пробиркам. Клетки можно хранить при 4°С 12-24 ч.

Примечание. Для максимальной эффективности трансфор­мации очень важно, 1) чтобы бактерии находились в лога­рифмической фазе роста и чтобы во время обработки хлористым кальцием плотность суспензии была низкой; 2) чтобы клет­ки выдерживались при 4°С 12—24 ч. За это время эффективность трансформации возрастает в 4—6 раз (Dagert, Ehrlich, 1979). Через 48 ч она снизится до первоначального уровня.

6. Добавьте ДНК в буфере, применяемом для реакции с ли- газами (лигазный буфер), или в буфере ТЕ. Размешайте и ин кубируйте смесь во льду 30 мин. Для каждой пробы можно брать до 40 нг ДНК (соответственно 100 мкл лигазного 6уфе- ра или буфера ТЕ). Увеличение количества ДНК или объема буфера приводит к снижению эффективности трансформации

7. Перенесите пробы в водяную баню (42°С) на 2 мин

8. Добавьте в каждую пробирку по 1,0 мл бульона L и ин-­ кубируйте 30 мин при 37 °С (при тетрациклиновой селекции) или 1 ч (при ампициллиновой или канамициновой селекции) без качания. За это время в бактериях пройдет процесс вос-­ становления и начнется экспрессия генов устойчивости к анти-­ биотикам.

9. Высейте удобное количество клеток на плотную селектив-­ ную среду, используя методику растирания (распределения клеток шпателем) или методику верхнего агара*. В пос­- леднем случае трансформантов получается несколько больше.

Если селекцию ведут на устойчивость к тетрациклину, то трансформационную смесь можно целиком высеять в одну чашку. При селекции на устойчивость к ампициллину в чашку следует высевать только часть культуры (найденную эмпири­чески), так как число вырастающих трансформантов увеличи­вается не пропорционально высеваемому объему, возможно, из-за накопления в среде токсичных веществ, выделяемых убиты­ми антибиотиком клетками. Кроме того, при селекции на ус­тойчивость к ампициллину плотность высеваемой суспензии должна быть низкой, а чашки нужно перенести через 16—24 ч; из термостата в холодильник (4°С). Дело в том, что ампицил­лин разрушается -лактамазой, секретируемой устойчивыми трансформантами, поэтому при густом засеве или длительной инкубации вокруг колоний трансформантов вырастут сателлитные колонии, сформированные чувствительными к антибиоти­ку клетками.

10. Оставьте чашки при комнатной температуре, пока не затвердеет верхний агар или не впитается жидкость.

11. Переверните чашки и инкубируйте их при 37 ^оС. Коло­нии должны появиться через 12—16 ч.

Приготовление плотной селективной среды с тетрациклином.

Приготовьте раствор тетрациклингидрохлорида с концентрацией 12,5 мг/мл в смеси этанол – вода (50% по объему). Простерилизуйте его фильтрованием и храните порциями при –20 ^оС в темноте (например, во флаконах, обернутых алюминиевой фольгой).

Для чашек. После автоклавирования охладите среду до 55 ^оС и добавьте тетрациклин до конечной концентрации 12,5 – 15,0 мкг/мл. Так как тетрациклин разрушается на свету, чашки следует хранить при температуре 4 ^оС в темноте.

Примечание. Ионы магния являются антагонистами тетрациклина. Поэтому для выращивания бактерий в присутствии этого антибиотика лучше использовать среды без солей магния (например, среду LB). Если нужна более богатая среда, то можно использовать среду 1776, в которую вместо хлористого магния добавлен хлористый натрий (6 г/л).

Среда LB (Лурия-Бертани)

На 1 л: Триптон 10 г

Дрожжевой экстракт 5 г

Na Cl 10 г

Довести рН до 7,5 с помощью NaOH

Агар Bacto 15 г

Проавтоклавировать и разлить по чашкам.

Задание: