Иммуноферментный анализ (ифа)

В настоящее время ИФА является наиболее широко распространенным иммунологическим методом. Принцип ИФА аналогичен непрямому варианту МФА, но имеет ряд отличий:

1) антитела или антигены фиксируются не на стеклах, а на внутренней поверхности синтетических планшетов для иммунологических реакций;

2) в качестве метки используется не флюорохром, а фермент (пероксидаза, щелочная фосфатаза, уреаза и др.);

3) реакция учитывается не под микроскопом, а визуально, после добавления в лунку субстрата для данного фермента.

Для объективной оценки результатов ИФА используют специальные фотометры с вертикальным ходом лучей.

Радиоиммунный анализ (риа)

Принцип анализа аналогичен ИФА, но в качестве метки используют не фермент, а радиоактивный изотоп.

Для определения антигенов и антител разработаны многочисленные варианты иммунологического анализа, которые предусматривают использование меченных различным образом реактивов.

Радиоактивное мечение изотопом 131J, а в последнее время все чаще 125J- многократно проверенный и надежный метод. Но реактивы нестабильны в результате радиоактивного распада и опасны для здоровья.

Иммунорадиометрическое определение антигена отличается от радиоиммунологического тем, что используются изотопы меченого реагента. Для определения антигена твердую поверхность, например пластиковую, нагружают антителами и добавляют исследуемый раствор. После отмывания количество антигена, связавшегося с пластиком, можно определить, добавляя избыток радиоактивно меченных антител. Специфичность метода повышается при использовании "твердофазных" и меченых антител, направленных к разным участкам антигена.

Антигены в сложной смеси могут быть идентифицированы методом иммуноблоттинга. Белки после разделения сложной их смеси методом электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле можно перенести из геля на микропористую нитроцеллюлозную мембрану. Далее неспецифически связанные с мембраной антигены могут быть идентифицированы с помощью меченых антител. Если белки антисыворотки разделить изоэлектрофокусированием, а затем перенести (блоттинг) на мембрану, то с помощью меченого антигена можно установить и так называемый спектротип антисыворотки, т.е. определить изотип антител, взаимодействующих с данным антигеном.

Методические подходы к диагностике аллергических заболеваний

Обращают на себя внимание тяжесть и длительность проявлений аллергических заболеваний, приводящих к длительной нетрудоспособности наиболее молодых слоев общества. Поэтому ранняя специфическая диагностика аллергопатологии является актуальной.

Основным принципом выявления истинных аллергических реакций (заболеваний) является обнаружение специфических антител или факта их присутствия. Все методы специфической диагностики базируются на знании свойств аллергических антител:

1) способности реагинов фиксироваться в коже и слизистых, что позволило с диагностической целью использовать кожные тесты: прямые (приктест, скарификационные, внутрикожный), непрямые (тест Праустница - Кюстнера) и провокационные (ингаляционный, конъюнктивальный, назальный).

2) способности IgE фиксироваться в клетках-мишенях с последующими, видимыми под микроскопом морфологическими изменениями их и, соответственно, использованием клеточных прямых и непрямых тестов - тест дегрануляции тучных клеток, базофилов.

3) способности аллергических антител к преципитации и, соответственно, использование тестов преципитации в сыворотке или агаре (при сывороточной болезни). Высвобождение под действием комплекса антиген - антитело медиаторов аллергии повлекло за собой внедрение многочисленных тестов определения биологически активных веществ (гистамина, серотонина, ацетилхолина, простагландинов, интерлейкинов и др.).

Следует отметить, что эти методы очень сложные, требующие дорогостоящего оборудования и реактивов.

Для специализированной диагностики аллергических реакций используются методы, позволяющие непосредственно обнаружить аллергические антитела в сыворотке и секретах (слюне, бронхиальных смывах, назальном секрете и т.д.

При аллергическом обследовании условно можно выделить тесты 1-го, 2-го. 3-го уровней.

Тесты 1-го уровня позволяют выявить выраженные нарушения в аллергическом статусе, являются информативными, специфическими, с достаточной степенью вероятности позволяют диагностировать атипические заболевания, даже протекающие латентно.

1. Аллергический анамнез.

2. Фармакологический анамнез.

3. Пищевой анамнез.

4. Тесты с атопическими аллергенами.

5. Уровень общего IgE в сыворотке.

6. Лабораторные методы - клинический анализ крови (эозинофилия), цитологическое исследование секретов (мазки из носа, конъюнктивы и т.д.) на эозинофилию.

Тесты 1-го уровня должны выполняться в любом аллергологическом кабинете в поликлинических условиях.

Тесты 2-го уровня позволяют диагностировать заболевания нереагинового типа, атопические заболевания, наличие которых предполагается при сборе аллергического анамнеза, но не удается выявить в тестах 1-го уровня. Сюда входят тесты для более углубленного обследования, позволяющие уточнить природу заболевания и назначить патогенетическую терапию.

1. Внутрикожные тесты с аллергенами.

2. Провокационные тесты (ингаляционный, оральные, назальные, конъюнктивальные)

3. Уровень специфических IgE.

4. Базофильный тест Шелли.

5. Тесты преципитации, позволяющие выявить наличие преципитирующих антител.

6. Иммунный статус.

7. Клеточные тесты.

Тесты 2-го уровня выполняются как в амбулатории, так и в стационаре.

Тесты 3-го уровня можно выполнять только в крупных аллергологических центрах. Они позволяют выявить интимные механизмы аллергических заболеваний и часто представляют собой больше научный интерес, чем практический.

1. Определение специфических IgG в сыворотке (субклассов IgG).

2. Специфическое высвобождение гистамина из базофилов.

3. Изучение состояния системы интерлейкинов.

4. Определение уровня простагландинов.

5. Изучение чувствительности рецепторного аппарата к специфическим антигенам и неспецифическим медиаторам.

6. Определение уровня медиаторов аллергии, ферментов и других биологически активных веществ, участвующих в аллергических реакциях.

Несомненно, что тесты 2-го и 3-го уровней будут пополняться новыми методами, разработанными по мере совершенствования наших знаний.