Исследование крови.

Морфология форменных элементов.

Все форменные элементы крови рептилий, также как у птиц, рыб и амфибий имеют ядра. Кроме того, в разных группах рептилий имеются значительные различия в морфологии циркулирующих клеток и физиологических нормах гематологических показателей. У одних ящериц, таких как игуаны или вараны, кровь имеет гетерофильный профиль (то есть доминируют гетерофилы), у других – лимфоцитарный, а у отдельных видов (например, у некоторых пресноводных черепах) могут доминировать базофилы. Нормальные показатели крови могут варьировать в зависимости от возраста, пола, времени года, условий содержания (в неволе или в природе) и кормления. Кроме того, на результаты анализа влияет техника взятия материала и лабораторные методы. Поэтому «нормы», которые публикуют разные авторы, могут заметно отличаться друг от друга. Усредненные значения для «всех рептилий» или «всех ящериц» вообще не пригодны для сравнения с собственными данными. Поэтому любая лаборатория, работающая с кровью рептилий, должна вначале обработать определенный серийный материал, полученный от клинически здоровых животных (порядка 100-200 исследований), чтобы охарактеризовать собственные «нормы» для нескольких конкретных видов. При этом нужно всегда пользоваться одинаковыми методиками. Полученные результаты могут отличаться от опубликованных в литературе, однако их вполне можно использовать для сравнения в случае патологии или при исследовании динамики заболевания в процессе терапии. Охарактеризовать «абсолютные» значения параметров крови можно только с помощью унифицированных методов, минимизирующих любые артефакты. Такие методы для рептилий пока не разработаны. Поэтому все «нормальные» показатели крови не нужно воспринимать как «абсолют», а только как относительную норму. Например, подсчитав количество эритроцитов у нескольких тупорылых крокодилов (N=5), мы получим цифру 60-400 тыс/мкл (эти данные приводит ISIS – международный информационный банк зоопарков – ISIS/ In-House Reference Values, 2001). Если посмотреть нормы для других видов крокодилов или усредненные нормы для крокодилов «вообще», то они будут составлять порядка 600-800 тыс/мкл. Значит, либо у всех исследованных нами особей тупорылых крокодилов тяжелая анемия, либо выбранная нами методика подсчета эритроцитов дает сильную погрешность, либо у данного вида крокодилов общее количество эритроцитов является в норме очень низким. Как интерпретировать такие данные? Можно воспользоваться другой методикой, например, подсчитать количество эритроцитов с помощью автоматизированного счетчика или по окрашенному мазку и сравнить полученные результаты. Если количество эритроцитов окажется выше, вероятно, данный метод будет давать значения более близкие к абсолютным, и следует выбрать именно такую методику. Можно также оставить попытки приблизить полученную «норму» к абсолютным значениям и считать, что анемия тупорылого крокодила характеризуется снижением общего количества эритроцитов менее 50 тыс/мкл. В дальнейшем, когда количество исследованных особей приблизится к нескольким десяткам, наша «норма» расширится, откорректируется и станет лучше отражать ситуацию при условии, что методика всегда будет одинаковой.

При характеристике форменных элементов крови рептилий возникают не только сложности в связи с морфологическими различиями у разных видов, но и некоторая путаница с базовой терминологией. Циркулирующие мононуклеары – лимфоциты и моноциты, очень похожи у всех позвоночных животных, а вот среди линий гранулоцитов имеются существенные различия и гетерогенность. Гетерофилы рептилий и птиц, по сравнению с гомологичными им нейтрофилами млекопитающих, имеют более высокую изоэлектрическую точку и окрашиваются эозинофильно. Термин «гетерофил» или «псевдо-эозинофил» часто применяют для нейтрофилов кроликов, морских свинок и гистрикоморфных грызунов из-за выраженной эозинофильной окраски их гранул. Гетерофилы этих животных функционально и биохимически эквивалентны нейтрофилам других млекопитающих, а вот у рептилий сходство проявляется только в функции, так как имеются биохимические различия. У большинства рептилий, за исключением некоторых ящериц и змей, имеется второй тип гранулоцитов, окрашивающихся ацидофильно. В связи с этим некоторые авторы применяют термин «ацидофил» к обоим типам клеток – и к гетерофилам, и к эозинофилам. Ацидофилы рептилий имеют широкую видоспецифическую вариабельность в размерах, морфологии ядер и гранул. Черепахи и крокодилы имеют 2 типа ацидофилов, которые по Сен-Жирону происходят из единого клеточного ствола и соответствуют нейтрофилам и эозинофилам млекопитающих (Saint-Girons, 1970). Pienaar (1962) называет их ацидофилами I и II типа. Другие авторы (Mateo, et al, 1984) считают, что каждый тип клеток происходит от независимых предшественников (эозинофильного и гетерофильного) и называют эти клетки «эозинофил» и «гетерофил» - такая терминология сейчас принимается большинством авторов. У чешуйчатых второй тип ацидофилов (эозинофилы) встречается редко. Ультраструктура единственного типа клеток (ацидофил I типа или гетерофил) показывает, что у этой клеточной линии может быть более 1 предшественника, по крайней мере, у ящериц (Kelenyi, Nemeth, 1969; Zapata, et al, 1981). Для чешуйчатых большинство авторов использует термин «гетерофил». Чешуйчатые также имеют другой уникальный тип лейкоцитов – азурофилы. Это круглые клетки с единственным ядром и нежными азурофильными гранулами. Они одновременно сочетают в себе морфологические черты моноцита и гранулоцита. У ящериц азурофилы в своей средней фазе развития могут напоминать нейтрофилы млекопитающих или другие типы гранулоцитов. Это вызывает путаницу, так как некоторые авторы называют этот тип клеток «нейтрофилами» (Frye,1991). В некоторых немецких пособиях «нейтрофилами» также именуют азурофилы, а не нейтрофильно окрашивающиеся видоспецифичные типы гетерофилов. Это совершенно не правильно, так как азурофилы происходят из моноцитарного ствола и не имеют отношения к гранулоцитарному стволу. Согласно теории происхождения лейкоцитов, нейтрофилы есть только у круглоротых, костных рыб, амфибий и млекопитающих, и отсутствуют у акул, рептилий и птиц. Чтобы избежать путаницы, мы будем всегда использовать термины «гетерофил» для обозначения ацидофилов I типа, «эозинофил» для обозначения ацидофилов II типа и «азурофил» для обозначения клеток моноцитарного ряда, содержащих гранулы. Термин «нейтрофил» для рептилий лучше вообще не использовать.

Эритроциты.

У всех рептилий эритроциты имеют овальную форму и обычно одно ядро. Их богатая гемоглобином цитоплазма окрашивается по Романовскому в различные оттенки желтого или кирпичного цвета у ящериц и змей, а у черепах и крокодилов может быть зеленоватой или голубоватой. В отличие от эритроцитов млекопитающих, имеющих двояко вогнутую форму, эритроциты рептилий сплющены, и в области ядра их форма слегка выпуклая. Вариабельность эритроцитов у рептилий более выражена, чем у других позвоночных. У ящериц размеры эритроцитов наиболее мелкие среди всех рептилий и в среднем составляют 14-18 х 8-10 мкм (у зеленой игуаны – 15,3 х 7,8 мкм). У черепах размеры эритроцитов составляют около 20 х 11 мкм. Количество эритроцитов негативно коррелирует с их размерами, поэтому у ящериц их количество максимальное – у большинства видов более 1 млн/мкл, иногда до 2 млн. Норма для зеленых игуан составляет 0,8-2 млн/мкл. Иногда встречаются безъядерные эритроциты, и в этом случае их именуют «эритропластидами». Можно также наблюдать и свободные эритроцитарные ядра, которые называются «гематогонами». Клиническое значение этих элементов не установлено. Умеренный пойкилоцитоз и анизоцитоз – норма для многих видов. Сильнее всего они выражены при регенеративных анемиях. Появление эритроцитов грушевидной, веретеновидной, округлой и других аномальных форм обычно является артефактом, наиболее выраженным по краям мазка. Истинный сфероцитоз, и особенно, микросфероцитоз является важным клиническим признаком и у высших позвоночных часто сопровождает некоторые аутоиммунные заболевания. Frye (1991) указывает, что у рептилий с ревматоидным артритом или волчаночным синдромом, массовое появление мелких сфероцитов – один из основных симптомов, характеризующих патологию. Cambell (1996) утверждает, что базофильная зернистость появляется в цитоплазме эритроцитов в ответ на анемию, дефицит железа или при отравлении свинцом. Гипохромные эритроциты появляются при железодефицитных анемиях в стадии ремиссии или при хронической кровопотере. Юные эритроциты обычны у молодых. Их количество возрастает во время линьки, при анемиях и кровопотере (иногда в значительном количестве). При выраженных регенеративных процессах эритроциты часто становятся двуядерными, митотически активными или сегментоядерными. Сходные изменения могут быть при воспалениях или после зимовки. Изменение формы ядер может быть связано с воспалением, истощением, алиментарной дистрофией. Настоящие ретикулоциты рептилий, также как юные полихроматофильные эритроциты, окрашиваются специальными суправитальными красителями, такими как новый метиленовый синий или бриллиантовый крезил синий, что позволяет отличить их от клеток других типов. Неизвестно, какие факторы, за исключением анемии, стимулируют эритропоэз у рептилий. Гипоксия и высокогорные условия не вызывают изменения величины гематокрита или гемоглобина у черепах и ящериц (Dessaeur, 1970; Atland, Thompson, 1958). Однако, в случае метастатической минерализации почек и, особенно, легких, у игуан в периферической крови в некоторых случаях появляется выраженная регенеративная реакция, которую связывают с гипоксией или гиперпродукцией эритропоэтина (Garner, 2001). Интересно, что ящерица (Lacerta sp.), подвергнутая тироидэктомии, погибла через 8 недель с картиной тяжелой апластической анемии и резко сниженным гемопоэзом в костном мозге ( ).

Гемопаразиты обычны в крови рептилий. Большинство их находятся в эритроцитах, но некоторые виды и в лейкоцитах. Чаще это паразитирование протекает бессимптомно. В клинических формах может отмечаться анемия. Ее могут вызывать трипаносомы; Hemogregarina (водные рептилии); Hepatozoon, Kariolysis (ящерицы Старого света); Plasmodium, Hemoproteus, Saurocytozoon, Schellackia, Lainssonia, Babesia, Aegyptionella, Sauroplasma, Leishmania (в тромбоцитах, моноцитах и лимфоцитах). Saurocytozoon обитает в лейкоцитах, остальные – в эритроцитах. В эритроцитах могут быть видны различные тельца включений. Мелкие базофильные включения в эритроцитах пустынных черепах, по-видимому, представляют деградирующие органеллы при хронических болезнях. В течение многих лет их считали кровепаразитами и пытались лечить. В эритроцитах любых рептилий могут встречаться мелкие округлые включения – остатки деградирующего хроматина. Обычно они располагаются на полюсах клетки. По аналогии с эритроцитами млекопитающих их называют тельцами Жолли, хотя ядра в эритроцитах рептилий при этом сохраняются. Помимо деградирующих органелл, в эритроцитах могут встречаться различные включения экзогенного происхождения, которые напоминают прозрачные вакуоли с четко выраженной мембраной или окрашиваются от эозинофильного до базофильного спектра. Pienaar (1962) называет их «альбуминоидными тельцами». Их размер колеблется в пределах 1-8 мкм, и клиническое значение не совсем понятно. Более мелкие включения, размером 1-2 мкм относят к пироплазмам и называют Sauroplasma, Serpentoplasma или Chelonoplasma в зависимости от видовой принадлежности хозяина. Их происхождение не до конца выяснено, и таксономический статус является спорным. Frank (1984) считает эти включения, также как и альбуминоидные тельца, артефактами, связанными с фиксацией или окраской мазков. С этим нельзя согласиться, так как подобные включения прекрасно видны в нативных неокрашенных эритроцитах, если применить фазовый контраст. Иногда при окраске по Романовскому в них выявляется базофильный материал, напоминающий хроматин. Telford (1984) пишет, что Sauroplasma «однозначно является организмом» и имеет экзогенное происхождение. До настоящего времени вопрос о том, как квалифицировать эти включения не решен, однако цитоспецифическая окраска с помощью Lymphocolor показывает, что данные включения точно не являются артефактами (Frye, 1991). В эритроцитах также не редко встречаются более крупные включения, которые связывают с присутствием иридовирусов или герпесвирусов. Полихромазия в отдельных случаях проявляется крупными вакуолями, не имеющими выраженной мембраны. Такие «вакуолизированные» эритроциты встречаются при гемолитических анемиях, гепатопатиях, хронических нефритах у игуан и других ящериц. У игуан иногда оказываются пораженными до 90% эритроцитов. Подобные вакуоли могут присутствовать и в гетерофилах. Frye (1991) также сообщает о подобных включениях у игуан и у гремучника Митчелла, у которого отмечались спонтанные геморрагии на слизистых ротовой полости и пищевода. Фрай считает эти включения экзогенными организмами. Мы склоняемся к мысли, что, хотя эти «альбуминоидные тельца» не являются артефактами (так как они видны в неокрашенных эритроцитах при фазовоконтрастной микроскопии), они, скорее всего, имеют эндогенное происхождение и могут проявляться при некоторых формах анемии. После курса катозала или патогенетической терапии основного заболевания количество атипичных эритроцитов, как правило, снижается.

Долгая жизнь эритроцитов рептилий (порядка 600-800 дней) делает ответ на анемию минимальным и пролонгированным, за исключением регенеративных реакций при острых кровопотерях. Митозы в эритроцитах рептилий – обычное явление, которое редко связано с онкологией. Особенно значительно отличаются мазки крови у ящериц с паразитарной гемолитической анемией.

Тромбоциты.

У всех рептилий, за исключением гаттерий, тромбоциты представляют собой сравнительно мелкие, размером 8-16 х 5-9 мкм, ядерные клетки овальной или веретеновидной формы со слабо базофильной, почти прозрачной цитоплазмой и центрально расположенным ядром. Ядра тромбоцитов содержат уплотненный хроматин, что делает их более базофильными по сравнению с ядрами похожих на них мелких лимфоцитов. Эти клетки имеют тенденцию к адгезии, и даже в быстро приготовленных мазках часто образуют агрегаты. На электронных микрофотографиях тромбоцитов видны тонкие псевдоподии, содержащие нежный гранулированный материал. Тромбоциты образуются из мегакариоцитоподобных многоядерных клеток в костном мозге и органах экстрамедуллярного гемопоэза рептилий. Специфическая окраска мегакариоцитов рептилий на лизосомальные ферменты положительна. Эти клетки, также как и взрослые тромбоциты, сохраняют способность к фагоцитозу (Frye, 1991). В цитоплазме тромбоцитов можно встретить бактерий, фрагменты разрушенных эритроцитов и неклеточный детрит. Но основная их функция такая же, как у высших позвоночных – осуществление гемостаза и заживление ран. Интересно, что тромбоциты рептилий сохраняют ограниченную полипотентность. При определенных условиях (анемии, кровепаразитарные заболевания) тромбоциты начинают увеличиваться в размерах, в их ядрах проявляются активные нуклеолы, и начинается синтез гемоглобина, постепенно заполняющего цитоплазму. Этот феномен был впервые описан Ф. Фраем, а этапы накопления гемоглобина прослежены с помощью бензидин-пероксидазной реакции (Frye, 1991). Подобно эритроцитам, зрелые тромбоциты рептилий сохраняют способность к митозу и амитотическому делению. Поэтому обнаружение в крови незначительного количества двуядерных форм можно считать нормой.

У клинически здоровых рептилий общее количество тромбоцитов в крови подвержено сезонным вариациям. В среднем, их количество примерно соответствует количеству лейкоцитов (10-19 тыс/мкл). У разных видов на 100 лейкоцитов встречается до 25-350 тромбоцитов. Тромбоцитопения встречается при ДВС-подобных коагулопатиях. В мазках крови больных рептилий часто присутствуют умеренно реактивные тромбоциты с измененными тинкториальными свойствами. Полиморфноядерные тромбоциты могут встречаться при сильных воспалительных реакциях, например, при сальмонеллезной септицемии.

Гетерофилы.

В мазках периферической крови черепах и крокодилов, окрашенных по Романовскому или Райту, гетерофилы имеют единственное базофильное ядро, расположенное эксцентрично, и эозинофильные веретеновидные гранулы. У чешуйчатых гетерофилы имеют круглые или сегментированные ядра и эозинофильные гранулы многоугольной или плеоморфной формы. Размеры гетерофилов ящериц колеблются в пределах 13-17 мкм. В гетерофилах змей ядра обычно одиночные, гранулы плохо сформированы, у ящериц гетерофилы полиморфноядерные, а гранулы веретеновидные, палочковидные или плеоморфные. В молодых гетерофилах ядро обычно овальное, а гранулы имеют округлую форму. В более зрелых клетках количество сегментов ядра увеличивается до 2-3, в зависимости от вида ящериц. Большее количество сегментов не нормально и встречается при токсемии (гиперсегментация). Морфология и количество гранул имеет значительные видоспецифические вариации. У игуан максимальное количество кирпичных палочковидных гранул имеется в зрелых гетерофилах. В молодых клетках количество гранул в 2-3 раза меньше, они сферические и красно-оранжевые. У водяных агам, как и у некоторых других ящериц, зрелые гетерофилы сохраняют «ювенильные» черты и содержат округлые и нерегулярные гранулы. Встречается много клеток, где имеется всего 2-3 таких гранулы (Le Blanc, 2001). Окраска и форма гранул может значительно изменяться при изготовлении мазков. В мазках, окрашенных Diff-Quick и другими модификациями азур-эозина, гранулы гетерофилов значительно менее эозинофильны и хуже различимы, чем в модификациях окраски по Романовскому. В срезах, окрашенных гематоксилин-эозином, гранулы гетерофилов теряют свою специфичность и округляются. Они по-прежнему окрашиваются эозинофильно, но иногда их оттенок становится желто-коричневым или медным, так что их можно спутать с отложениями гемосидерина.

Функции гетерофилов рептилий аналогичны таковым у нейтрофилов млекопитающих. Они включают фагоцитоз и бактерицидную активность. При различных типах воспаления происходит аккумуляция гетерофилов в воспалительном очаге, с их последующей дегрануляцией, некрозом и формированием гетерофильной гранулемы (см раздел «Воспаление»). У птиц и рептилий, имеющих также эозинофилы, главное отличие между этими двумя типами клеток заключается в том, что гетерофилы не имеют миелопероксидазы и щелочной фосфатазы (Brune, Spitznagel, 1973). От нейтрофилов млекопитающих гетерофилы отличаются отсутствием некоторых протеаз (например, катепсина) и пониженной гидролитической активностью. Единственный ацидофил чешуйчатых, возможно, комбинирует функции гетерофила и эозинофила в одной клетке, что косвенно подтверждается наличием в ней пероксидазной активности (Montali, 1988). В крови большинства рептилий с гетерофильным профилем их количество составляет 30-45%. Относительное количество гетерофилов может увеличиваться до 70% и более при многих воспалительных процессах, в том числе, не только бактериальной, но и грибковой, вирусной и даже паразитарной этиологии. Особенно гетерофилия выражена при сепсисе и некрозе, лейкозного уровня абсолютная гетерофилия достигает при миелоидном лейкозе (Rosskopff, Woerpel, Pitts, 1983). Гетеропения и даже агранулоцитоз встречаются при хронических инфекциях, особенно вирусных, типа IBD, а также при бактериальном хрониосепсисе. Токсически измененные гетерофилы можно обнаружить при сильном воспалении, особенно бактериальном, или при токсемии. Эти изменения включают базофильную реакцию и вакуолизацию цитоплазмы, гиперсегментацию ядер и изменения формы и тинкториальных свойств гранул. Дегрануляция гетерофилов происходит в воспалительном очаге, в периферической крови это характеризует левый сдвиг лейкоцитарного ядра или токсические изменения клеток.

Эозинофилы.

У черепах и крокодилов эозинофилы по размеру (12-17 мкм) сравнимы с гетерофилами. Они имеют овальное или двухлопастное эксцентричное ядро и крупные сферические эозинофильные гранулы. Большинство змей, например, такие распространенные виды, как тигровый и королевский питон или маисовый полоз, не имеют эозинофилов. У тех видов змей, у которых они есть, эозинофилы обычно крупнее, чем у других рептилий, порядка 17-20 мкм (Campbell, 1996). Эозинофилы ящериц, даже у тех видов, у которых они есть, в периферической крови можно встретить очень редко. У зеленых игуан эозинофил несколько крупнее гетерофила, имеет одиночное ядро и крупные овальные гранулы фиолетового цвета (при окраске по Романовскому). Вариации в форме и окраске гранул эозинофилов в целом характерны для всех низших позвоночных и птиц. Например, эозинофильные гранулы у венценосного голубя имеют палочковидную форму, а у удода они ярко-голубые. Эозинофилы черепах пероксидаза-позитивны и легко отличаются от гетерофилов с помощью простейших цитохимических процедур, например, с помощью бензидиновой пробы или реакции с р-фенилендиамином. Ультраструктура ацидофилов у рептилий и птиц широко варьирует и в основном остается не изученной. При световой микроскопии дифференцируется только один тип гранул. На электронных микрофотографиях крупные электронно-позитивные сферические гранулы соответствуют овальным на окрашенных препаратах, меньшие по размеру и более короткие – палочковидные гранулы, видны только под электронным микроскопом. Третий тип – мелкие, округлые, электронно-негативные гранулы периодически выявляются у разных видов птиц. У млекопитающих в гранулах эозинофилов имеется кристаллоидный материал, которого нет в гранулах нейтрофилов. Похожий материал выявляется в эозинофилах некоторых водоплавающих птиц, но отсутствует у куриных и рептилий (Maxwell, 1979). Парадоксально, что гранулоциты гаттерий, амфибий и рыб больше напоминают клетки млекопитающих, чем рептилий (Montali, 1988).

Функцию эозинофилов у млекопитающих связывают в основном с реакциями ГНТ и супрессией при гельминтозах. Функции эозинофилов птиц и рептилий не так хорошо выяснены. У этих животных эозинофилию крайне сложно вызвать экспериментально с помощью антигенов паразитов, но многократные внутриполостные инъекции бычьего альбумина с гидроксидом алюминия вызывают у цыплят системную эозинофильную реакцию. Данные других экспериментов показывают, что у птиц эозинофилы могут принимать участие в реакциях ГЗТ. Эозинофилия (более 60%) наблюдается у аллигаторов с экспериментальной инвазией пиявок, но у спонтанно инвазированных в природе животных ее не отмечали (Montali, 1988). У рептилий, по-видимому, эозинофилы участвуют в фагоцитозе иммунных комплексов, образующихся в присутствии паразитов, и, возможно, в реакциях ГЗТ.

У черепах отмечают максимальный процент эозинофилов среди всех рептилий (в норме до 15-20%), у ящериц – наименьший (0-2%). У видов, для которых в норме характерен достаточно высокий уровень эозинофилов, эозинофилия может в приближении указывать на инвазию гельминтов. Эти корреляции наиболее выражены у пустынных, водных и коробчатых черепах (Rosskopf, 2000). Менее выражена эозинофилия при инвазии кровепаразитов. У зимующих рептилий флуктуация эозинофилов в периферической крови – нормальное явление. Периоды повышенной активности животных характеризуются снижением абсолютного количества эозинофилов, и наоборот (Raskin, 1999). У черепах эозинопению отмечают в середине лета, эозинофилию – во время зимовки.

Базофилы.

Все рептилии имеют базофилы. Это округлые клетки с крупными, круглыми, сильно базофильными метахроматическими гранулами, которые часто закрывают центрально расположенное ядро. В этих случаях базофил напоминает ягоду ежевики. Размеры базофилов у ящериц в среднем составляют 8-12 мкм, у змей и черепах они крупнее – до 13-16 мкм, самые крупные базофилы (до 20 мкм) найдены у гаттерии. Базофилы рептилий часто окрашиваются метахроматически. Это связано с наличием в них двух типов гранул. Помимо крупных темно-базофильных гранул, в цитоплазме всегда имеются мелкие гранулы, красящиеся азурофильно. Метахромазия базофилов может иметь дифференциально-диагностическое значение. Некоторые рептилии, например, игуаны, имеют 2 типа базофилов: большие клетки с крупными (до 1 мкм) гранулами и маленькие, с очень многочисленными мелкими гранулами.

У рептилий, как и у других позвоночных, базофилы связываются с поверхностью иммуноглобулинов и реагируют дегрануляцией, высвобождая гистамин (Sypek, Borisenko, 1988). Базофилы в норме присутствуют в количестве 0-40% (в среднем 10-25%) в периферической крови разных видов рептилий. Базофильный профиль характерен для каймановой черепахи, у морских черепах наоборот, базофилы встречаются достаточно редко. Сезонные вариации базофилов незначительны. Их количество может повышаться при некоторых кровепаразитарных болезнях (инвазии гемогрегарин и трипаносом) или иридовирозах (Rosskopf, 2000). Этот же автор сообщал о базофилии у черепах при различных гельминтозах ЖКТ. Я наблюдал базофилию при хронической инфекции у некоторых видов черепах и ящериц, причем при острой инфекции иногда можно наблюдать гетерофилию, которая затем сменяется базофилией. Часто в крови ящериц можно встретить клетки с несколькими и даже полностью отсутствующими гранулами. Морфологически они больше всего напоминают дегранулированные базофилы, хотя мы не применяли гистохимические методы для их точной дифференциации. Базофилия у видов, в норме не имеющих эти клетки в большом количестве, должна оцениваться опытным клиницистом.

Лимфоциты

Как и у других позвоночных, в этом классе клеток существует морфологическая и функциональная гетерогенность. У большинства видов рептилий различают 2 типа лимфоцитов – мелкие и крупные, а у некоторых и 3 типа – мелкие, средние и крупные. Мелкие лимфоциты варьируют в размерах от 5,5 до 10 мкм, а крупные – в пределах 11-14 мкм. В лейкоцитарной формуле все лимфоциты подсчитываются как один тип клеток. Их цитоплазма окрашивается по Романовскому в бледно-голубой цвет и может содержать тонкую азурофильную зернистость или мелкие прозрачные (гиалиновые) включения. При бактериемии в лимфоцитах часто можно встретить фагоцитированные микроорганизмы и фрагменты эритроцитов. У многих видов ящериц (некоторые агамы, поясохвосты, вараны) кровь имеет лимфоцитарный профиль, и уровень лимфоцитов в норме может достигать 80%. Этот уровень, тем не менее, подвержен нормальным возрастным или сезонным вариациям. У молодых рептилий абсолютное количество лимфоцитов может быть слегка повышенным, это же характерно для самок. Количество лимфоцитов повышается в летние месяцы (у тропических видов во влажный сезон) и может резко снижаться во время зимовки. У некоторых черепах лимфоциты сразу после зимовки вообще отсутствуют в периферической крови. Их количество также снижается при голодании или плохом рационе. В связи с этим падение уровня лимфоцитов зимой и у животных с анорексией чревато иммуносупрессией. Повышение уровня лимфоцитов в норме происходит во время линьки, особенно у змей.

Функция лимфоцитов рептилий такая же, как у птиц и млекопитающих – продукция иммуноглобулинов и участие в клеточных иммунных реакциях. Лимфоцитоз обычен при хроническом воспалении и во время заживления ран. Некоторые вирусные инфекции сопровождаются выраженным лимфоцитозом, а при IBD у змей лимфоцитоз может даже достигать лейкемического уровня, превышая 100 тыс. клеток/мкл. При этом вирусные включения можно видеть непосредственно в лимфоцитах (в 1-2% клеток). Лимфобласты и пролимфоциты в периферической крови редки, и их появление может указывать на серьезную патологию. В ядрах пролимфоцитов и юных лимфоцитов обычно имеется хорошо выраженное ядрышко, реже их может быть 2. Эти клетки имеют более крупные ядра, более конденсированный хроматин и более базофильную цитоплазму. Единичные бластные формы встречаются при сильном воспалении, но чаще характеризуют лимфоретикулярные неоплазии. Единичные митотические фигуры можно встретить и в нормальной крови. Появление реактивных лимфоцитов говорит об антигенной стимуляции.

Плазматические клетки.

По морфологии плазмациты рептилий очень похожи на аналогичные клетки у млекопитающих. По размеру и окраске они напоминают лимфоциты, но в периферической крови обычно немногочисленны (0,2-0,5%). Цитоплазма плазмацитов окрашивается в более интенсивный голубой цвет, за исключением светлой парануклеарной зоны, которая является аппаратом Гольджи. Ядро у плазмацитов располагается несколько эксцентрично, меньше по размеру и гораздо темнее, чем у лимфоцитов. Иногда можно наблюдать более темную перинуклеарную зону конденсированного хроматина. В случае инфекции и иммунного воспаления количество плазмацитов может существенно повышаться. После сильной антигенной стимуляции могут появляться митотически активные клетки, а в цитоплазме плазмацитов - прозрачные тельца Рассела.

Моноциты.

Моноциты – самые крупные клетки периферической крови рептилий. Их размер превышает диаметр крупных лимфоцитов и у разных видов варьирует в пределах 8-20 мкм. Они очень похожи на такие же клетки млекопитающих и имеют светлую, серо-голубую, нежно гранулированную цитоплазму, часто содержащую вакуоли. Азурофильные вариации моноцитов (не путать с азурофилами!) известны у черепах. Ядро моноцитов чаще всего имеет подковообразную форму и содержит гранулированный хроматин. В цитоплазме активированных клеток почти всегда можно встретить фагоцитированный материал. У всех рептилий моноциты не многочисленны, порядка 0-10% (у большинства видов 0,5-3%). Однако, у некоторых видов змей и ящериц их количество может в норме достигать 10-20% (Hawkey, Dennett, 1989; Pienaar, 1962). Уровень моноцитов не подвержен сезонным вариациям. Моноцитоз у рептилий, как и у других животных, является маркером хронического воспаления. Их уровень особенно высок при формировании гистиоцитарных гранулем любой этиологии. Dotson с соавторами (1995) сообщают, что моноциты, в норме отсутствующие в крови у маисового полоза, тут же обнаруживаются при тяжелой бактериальной инфекции. При сильном воспалении в периферической крови можно наблюдать активированных макрофагов с характерной «вспененной» цитоплазмой. Нередко они появляются у самок игуан с желточным перитонитом. Их исчезновение является хорошим прогностическим признаком.

Азурофилы.

Азурофилы по размеру меньше моноцитов, имеют округлую форму и несегментированное ядро с компактным хроматином. Цитоплазма азурофилов выглядит красновато-бурой, но на самом деле окрашивается в бледный серо-голубой цвет. Красноватый оттенок ей придают многочисленные мелко- и грубозернистые азурофильные гранулы и нежные фибриллярные нити. В активированных клетках могут встречаться мелкие вакуоли и фагоцитированный материал. Азурофилы встречаются только у змей и ящериц, но далеко не у всех видов. Они вполне обычны у игуан. Эти клетки позитивно окрашиваются на пероксидазу, щелочную фосфатазу и селективный краситель нейтрофилов млекопитающих – Neutrocolor. Как уже обсуждалось выше, азурофилы разделяют морфологические черты нейтрофилов и моноцитов, но их функция явственно отличается от функции нейтрофилов млекопитающих. Они происходят из моноцитарного ствола и могут при определенных условиях морфологически преобразовываться в моноцитарный тип клеток (Will, 1978). У млекопитающих нейтрофилы также могут изменяться под воздействием инфекции и иногда совмещают фенотипические черты моноцитов и гранулоцитов. Клетки этого типа встречаются при лейкозе, классифицируемом как миеломоноцитарная лейкемия (Montali, 1988). У клинически здоровых ящериц количество азурофилов редко превышает 10% (в среднем 3-7%). Уровень азурофилов резко возрастает при антигенной стимуляции, особенно при моноцитарном ответе с участием IgM и IgY (Rosskopf, 2000). По нашему мнению, азурофилия – очень полезный маркер хронического гранулематозного воспаления. Так как у игуан их количество при воспалении значительно превышает количество моноцитов, изменение уровня азурофилов легче проследить в динамике. Schilling (1985) установил у ящериц 5 «групп гемограмм», характеризующихся моноцитозом и азурофилией: болезни печени, септическое воспаление, хронические инфекции, травмы и паразитозы. Вероятно, это справедливо и для других групп рептилий.

Общеклинический анализ крови (ОКА)

Общий объем крови у рептилий составляет приблизительно 5-8% от массы тела. У здорового животного можно без ущерба для него взять до 10% от общего объема крови, то есть у ящерицы массой 100 г можно взять около 0,7 мл. Разумеется, перед взятием крови не следует вводить животному химиопрепараты и кристаллоиды, тем более в тот же сосуд, из которого берется кровь. Кровь лучше брать из вены (технику венепункции см. в разделе «Инфузионная терапия») без антикоагулянта, или используя ЭДТА или литиевый гепарин. У млекопитающих в общеклинический анализ крови входят следующие исследования: определение гемоглобина, общего количества эритроцитов, лейкоцитов, лейкоцитарной формулы, а также вычисление цветового показателя, СОЭ и при необходимости таких расчетных показателей, как среднее содержание гемоглобина в одном эритроците, средний объем эритроцитов, средняя концентрация корпускулярного гемоглобина. Для рептилий в ОКА обычно не определяют СОЭ и цветовой показатель, однако обязательно определяют гематокрит и иногда уровень фибриногена. Кровь, в зависимости от задач исследования и размеров пациента, берут в объеме 0,5-2 мл, как правило, из вентральной хвостовой вены с помощью шприца или вакутайнера с гепарином. ЭДТА (трилон Б) у рептилий и птиц вызывает гемолиз эритроцитов, и поэтому не рекомендуется для использования в качестве антикоагулянта. Это справедливо при выполнении биохимического исследования, однако в некоторых случаях ЭДТА может быть предпочтительнее, чем гепарин. Во-первых, любые гепарины, в том числе, литиевый, сильно меняют тинкториальные свойства клеток, особенно гранулоцитов. Во-вторых, гепарин может влиять на результаты некоторых визуальных колориметрических методов (особенно, определение общего белка) и определение гематокрита. По данным Hanley, et al (2003) ЭДТА при проведении ОКА у 32 игуан достоверно давал меньше погрешностей, чем гепарин. Таким образом, для проведения только общеклинического анализа предпочтительнее использовать ЭДТА, но если кровь одновременно используют для биохимического анализа, лучше использовать гепарин. Для приготовления тонкого мазка антикоагулянты лучше вообще не использовать.

После взятия в шприц кровь быстро переносят в центрифужную пробирку с сепарирующим гелем, а оставшуюся часть в объеме 100-200 мкл используют для подсчета общего количества эритроцитов и лейкоцитов, определения гемоглобина, гематокрита и приготовления тонкого мазка. Кровь у рептилий сворачивается в течение примерно 40 секунд, поэтому все растворы и посуда для исследования должны находиться под рукой, и действовать нужно быстро. В противном случае лучше пользоваться антикоагулянтом, хотя это может вызвать дополнительные артефакты.

Определение гемоглобина

Концентрацию гемоглобина можно определить цианметгемоглобиновым методом или в автоматических гемоглобинометрах. При этом сначала необходимо отделить фракцию свободных эритроцитарных ядер с помощью центрифугирования. Нормальные показатели для различных видов колеблются между 6 и 12 г/дл.

Подсчет общего количества эритроцитов

Общее количество эритроцитов можно подсчитать с помощью автоматического счетчика или вручную в гемоцитометре, одновременно с определением количества лейкоцитов. При этом для подсчета обоих типов клеток используют одинаковое разведение 1:200. Если в лаборатории нет специальной разводящей жидкости, то для подсчета эритроцитов кровь можно развести обычным изотоническим раствором хлорида натрия: 20 мкл крови разводят в 4 мл физраствора. Затем эритроциты подсчитывают в 5 больших квадратах камеры Горяева, разграфленных на 16 малых, используя фазовый контраст. Счет ведут по диагонали. Полученную сумму умножают на 10 000. В этом случае определяется количество клеток в 1 мкл (1 мм³) крови.

Подсчет общего количества лейкоцитов

Так как все форменные элементы крови рептилий имеют ядра, методы подсчета лейкоцитов, используемые для млекопитающих, не подходят для рептилий. Если откалибровать автоматический счетчик на средний размер лейкоцитов рептилий, то он будет фиксировать также импульсы от тромбоцитов, проходящих через капиллярное отверстие, поскольку они по размерам идентичны мелким лимфоцитам. В результате полученная цифра будет превышать реальное количество лейкоцитов как минимум вдвое, а чаще в 3-4 раза. Использование 3% раствора уксусной кислоты также не подходит, поскольку невозможно дифференцированно разрушить эритроциты и другие ядерные элементы крови рептилий, сохранив исключительно лейкоциты. Поэтому для подсчета общего количества лейкоцитов используют специальные разводящие жидкости, содержащие фиксатор и различные красители. В таком растворе фиксируются и сохраняются все форменные элементы крови, однако лейкоциты или некоторые их типы окрашиваются дифференцировано. Это позволяет отличить их от других клеток и подсчитать. На основании этого принципа разработано несколько методов прямого и косвенного подсчета лейкоцитов в гемоцитометре, а также есть несколько методов приблизительной оценки этой величины по тонкому мазку, по лейкоцитарной пленке в микрогематокритовой трубке и др.

- Модификация «классического» метода (Васильев, Балакина, 1999). В разводящей жидкости (жидкость Тюрка) повышают концентрацию уксусной кислоты до 15%. При этом происходит разрушение цитоплазмы тромбоцитов и эритроцитов без разрушения лейкоцитов (для некоторых видов рептилий такой концентрации оказывается недостаточно и ее необходимо повышать до 20%). Однако тени разрушенных клеток и их ядра остаются и мешают подсчету. Добавив к разводящей жидкости двойное количество метилового фиолетового, мы вызвали прокрашивание гранул крупных гранулоцитов, таких как азурофилы, гетерофилы и эозинофилы. Далее подсчет производится стандартным методом в камере Горяева.

- Метод Натта и Геррика (Natt, Herrick, 1952) был изначально разработан для подсчета клеток в крови цыплят и модифицирован Биндером для рептилий (Frye, 1991). Этот раствор (формула Натта-Геррика) содержит формалин, буферные компоненты и краситель – метиловый фиолетовый 2B. Состав разводящей жидкости приведен ниже в таблице.

Таблица Формула Натта-Геррика для подсчета общего количества лейкоцитов в крови рептилий и птиц.

NaCl Na2SO4 Na2HPO4 : 12H2O KH2PO4 Формалин 36% метиловый фиолетовый 2B вода дистиллированная

3,88 гр 2,50 гр 2,91 гр 0,25 гр 7,50 мл 0,10 гр 1000 мл

Смесь разводят дистиллятом до объема 1 л, отстаивают в течение 12-24 часов и затем фильтруют через бумажный фильтр № 2. Пользоваться этим раствором можно в течение нескольких месяцев. К сожалению, он не выпускается в фабричной упаковке, и его нужно готовить самостоятельно. При подсчете клеток с помощью этого метода можно спутать лейкоциты с молодыми эритроцитами, так как оба типа клеток круглые и окрашиваются темнее. Можно также спутать у некоторых видов мелкие лейкоциты и тромбоциты. Ян Биндер (Frye,1991) обнаружил, что добавление 0,1 мл 1% раствора толуидинового синего к 10 мл жидкости Натта-Геррика непосредственно перед исследованием улучшает дифференциацию клеток.

- Метод с флоксином В. Этот метод, основанный на использовании коммерческого теста для определения количества эозинофилов млекопитающих (Eosinophil Unopett System), распространен в западных лабораториях. Краситель флоксин В, который содержится в разводящей жидкости, окрашивает гетерофилы и эозинофилы рептилий в ярко-красный цвет. Таким способом можно подсчитать их суммарное количество в 1 мкл крови. Затем по тонкому мазку считается суммарный процент этих клеток в лейкоцитарной формуле, и на основании этой цифры рассчитывается общее количество лейкоцитов в 1 мкл. Так как метод не является прямым, он может давать погрешность около 10%. Тем не менее, метод очень быстр, а главное, разводящую жидкость не нужно готовить самому. Поэтому его предпочитают частные врачи и коммерческие лаборатории, но в серьезных исследовательских центрах, разумеется, пользуются методикой Натта-Геррика, как более точной.

- Метод Риса и Экера. Готовый раствор (Rees&Ecker’s Solution) используют для подсчета тромбоцитов млекопитающих. Он производится на коммерческой основе и сохраняет стабильность не менее 6 месяцев. Раствор дифференцировано прокрашивает все клетки крови рептилий, хотя и менее ярко, чем при использовании методик, описанных выше. Метод был предложен Lawton, Divers (1999), однако не получил широкого распространения.

- Подсчет лейкоцитов по мазку. Это очень приблизительный метод, в англоязычной литературе именуемый LEFS (Leukocyte Estimate From Smear). Он включает подсчет лейкоцитов в моноклеточном слое крови тонкого мазка. Количество лейкоцитов считают в 10 или более полях зрения микроскопа при объективе × 40. Затем полученная сумма делится на количество полей зрения и умножается на 2000 (Fudge, 2000).По данным Centini, Klaphake (2002), проводивших сравнительную оценку результатов этого метода с методом Натта-Геррика, погрешность составляет около 16%, и результаты получаются, как правило, завышенными. Этот метод является самым простым, и не требует никаких дополнительных реактивов, однако, на наш взгляд, более чем приблизителен. В нескольких специально сравненных нами парных исследованиях погрешность составляла более 16%. Клетки крови в монослое мазка распределяются не равномерно, поэтому метод не может быть унифицирован. Все же, он позволяет выявить высокий лейкоцитоз или выраженную лейкопению, и может пригодиться врачу, вообще не имеющему контактов с лабораторией (например, в полевых условиях).

- Расчет общего количества лейкоцитов по толщине лейкоцитарной пленки. При определении гематокрита микрогематокритным методом кровью заполняют стандартный капилляр объемом 70 мкл и центрифугируют. В результате в капилляре происходит разделение эритроцитарной массы и плазмы. На поверхности эритроцитарного слоя, непосредственно под слоем плазмы, располагается тонкая лейкоцитарная пленка. Обычно она соответствует по толщине 1% общей гематокритной величины. Считается, что толщина пленки, равная 1% приблизительно соответствует общему количеству лейкоцитов 10 000/мкл. Увеличение толщины пленки на каждый следующий 1% соответствует увеличению общего количества лейкоцитов на 20 000 (Mader, 1999). То есть, если лейкоцитарная пленка занимает 2% гематокритной величины, то это приблизительно соответствует 30 000/мкл лейкоцитов. Lawton, Divers (1999) сравнивали этот метод с другими и выяснили, что некоторые корреляции наблюдаются только при исследовании крови змей. При этом толщина лейкоцитарного слоя около 0,5% соответствовала общему количеству лейкоцитов 6,8 тыс/мкл, а около 1% - 10,9 тыс/мкл. Таким образом, этот метод также является очень приблизительным, дает погрешность не менее 10%, и может быть рекомендован только для лабораторий, владеющих микрогематокритным методом, но не имеющих специальных реактивов для подсчета клеток в гемоцитометре.

В общем случае кровь для подсчета лейкоцитов (10 или 20 мкл) смешивают с разводящей жидкостью, добиваясь разведения 1:200, 1:100 или 1:20. Это «дело вкуса» специалиста, выполняющего анализ, однако следует помнить, что коэффициенты для подсчета в этих случаях будут отличаться. Затем кровь, смешанную с разводящей жидкостью, оставляют на 2-5 минут в видалевской пробирке или непосредственно в капилляре гемометра для лучшего окрашивания клеток, после чего еще раз взбалтывают и заполняют счетную камеру Горяева. Существуют разные мнения о количестве квадратов, в которых нужно считать клетки. Campbell (1996) рекомендует считать количество лейкоцитов в 10 больших квадратах, затем к полученному количеству прибавить 10% и умножить полученное число на 5000 (при разведении 1:200). Я предпочитаю считать лейкоциты в 100 больших квадратах (не разграфленных, объединенных по 4 – всего 25 штук) и затем полученную цифру умножать на 500. Это занимает больше времени, но дает меньшую погрешность.

Подсчет лейкоцитарной формулы

Лейкоцитарную формулу подсчитывают в окрашенном тонком мазке крови, микроскопируя его с иммерсионной системой. Для окраски мазков используют разные методы. Лучшим методом окраски крови, в том числе, для рептилий, считается окраска по Папенгейму. Для этого высушенный мазок на 3 минуты вносят в фиксирующую краску Май-Грюнвальда, затем промывают проточной водой и окрашивают по Романовскому в течение 20 минут. Существует также множество готовых модификаций окраски по Романовскому (Райт-Гимза, Нобль-Гимза, Гуголь-Гимза, Дженнер-Гимза и т.п.), которые используют в специализированных лабораториях. Для окраски этими методами мазок фиксируют в абсолютн6ом метаноле в течение 2 мин и затем окрашивают по выбранной методике от нескольких минут до 24 часов. Такие методы окраски, как Нобль-Гимза или Дженнер-Гимза позволяют сохранить мазки яркими в течение многих лет, и в основном используются для архивных целей (Frye, 1991). Для экспресс-окраски мазков в западных коммерческих лабораториях используют готовые модификации окраски азур-эозином: Diff-Quick или Dip Stat. В этом случае окраска мазков занимает всего 15 секунд. Мы также используем Diff-Quick для рутинных исследований, однако эталонные препараты всегда окрашиваем по Папенгейму. Для лучшей дифференциации клеток, особенно, если возникают сомнения о принадлежности нетипичных клеточных форм к определенному стволу гемопоэза, применяют селективные окраски серии Cytocolor из медицинской лабораторной практики (Cytocolor Inc. Hinckley, Ohio). Краска Lymphocolor используется для дифференциации различных типов лимфоцитов в мазках периферической крови и костного мозга. Granulocolor позволяет дифференцировать юные линии гранулоцитов. Neutrocolor позволяет дифференцировать азурофилы чешуйчатых. Megacolor специфично окрашивает мегакариоциты. Lysocolor позволяет выявить лизосомы в отдельных клетках гранулоцитарного ряда. Витальный краситель Panoptikon позволяет прижизненно окрашивать ядерный хроматин, нуклеолы и некоторые типы цитоплазматических гранул. Frye (1991) сообщает, что эти селективные красители, разработанные для окраски крови млекопитающих, дают вполне удовлетворительные результаты при работе с кровью и костным мозгом рептилий.

Определение гематокритной величины (PCV)

Стандартный капилляр для определения PCV микрогематокритным методом имеет объем 70 мкл, то есть такое количество крови можно взять у ящерицы массой всего 7 г. Гепаринизированный капилляр длиной 75 мм заполняют кровью до отметки 60 мкл и откручивают в микроцентрифуге в течение 3 мин при 5 тыс. об/мин. Для определения гематокрита у млекопитающих кровь центрифугируют в течение 5 мин при 8 тыс. об/мин. Это может вызвать разрушение крупных ядерных эритроцитов рептилий, и поэтому для них используют более мягкий режим центрифугирования. Результаты обычно определяют с помощью микрогематокритного счетчика или с помощью счетной шкалы, прилагаемой к центрифуге.

Расчетные величины MCV, MCH и MCHC

В случае анемий для дифференциальной диагностики рассчитывают такие величины, как средний объем эритроцитов (MCV), среднее содержание гемоглобина (MCH) и среднюю концентрацию корпускулярного гемоглобина (MCHC). Их можно определить по стандартным формулам, зная PCV (гематокрит), RBC (общее количество эритроцитов), и Hb (гемоглобин).

MCV=	PCV×10	;	MCH=	Hb×10	;	MCHC=	Hb×10
	RBC			RBC			PCV

Эти величины уже были определены для многих видов рептилий. Для животных с анемией эти величины следует учитывать для характеристики эритроцитарной патологии.

Таким образом, общеклинический анализ крови различных видов ящериц можно выполнить разными методами. Нормальные показатели крови животных даже одного и того же вида могут варьировать в достаточно широких пределах. Кроме того, существуют значительные межвидовые вариации. Поэтому еще раз хочу сказать, что каждая лаборатория должна ориентироваться прежде всего на собственные «нормы», полученные на приличном серийном материале. В связи с этим мы не будем приводить здесь условные «нормы» для разных видов ящериц, а только несколько усредненные нормы для зеленых игуан (см. таблицу ). Их вполне можно использовать для оценки «порядкового значения» собственных данных. Есть такая английская поговорка у врачей, которая переводится как «плохие лабораторные данные хуже, чем их отсутствие». Если полученные результаты существенно отличаются от приведенных здесь норм, значит либо выбранная методика не годится, либо у животного действительно серьезные отклонения. Такие исследования нужно обязательно повторять в динамике. Еще лучше использовать для контроля кровь клинически здорового животного того же вида. В любом случае, сравнение парных анализов с точки зрения диагностики будет более ценным, чем попытка сопоставить свои результаты с чужими литературными данными.

Таблица . Гематологические показатели, установленные для зеленых игуан (по данным разных авторов и на собственном материале).

Показатель	♂♂	♀♀	По нашим данным
Общее количество эритроцитов (х 106/мкл)	1,27­±0,23	1,48±0,19	0,8-2,0
Гемоглобин (г/дл)	9,1±5	10,7±1,5	3,5-5,5
Гематокрит (%)	33±4	38,2±4,4	24-37
Фибриноген (мг/дл)	117±39	130±67	84-160
Общее количество лейкоцитов (х 103/мкл)	15,2±6,4	13,3±5,7	4,5-10,0
Гетерофилы (%)	23±14	19±11	30-55
Лимфоциты (%)	63±14	69±16	40-55
Моноциты (%)	5±3	5±4	1-4
Эозинофилы (%)	1±1	1±1	0-2
Базофилы (%)	3±2	4±3	1-6
Азурофилы (%)	5±6	2±2	12-25

Биохимическое исследование крови.

Биохимическое исследование крови рептилий в последние годы стало обычным во многих лабораториях, имеющих биохимические анализаторы. Здесь, впрочем, существуют те же ограничения, о которых речь шла при обсуждении других методов лабораторных исследований. Биохимический профиль подвержен индивидуальным и сезонным вариациям, и может иметь существенные видоспецифические различия. Поэтому, опять же, проводя биохимическое исследование образца крови, взятого от больной ящерицы, лаборатория должна иметь для сравнения либо «нормы», установленные самостоятельно, либо кровь от клинически здоровой ящерицы того же вида. Методики исследования и качество реактивов могут существенно влиять на конечный результат. Лучше всего, разумеется, брать кровь непосредственно в лаборатории и сразу ее исследовать. Так как это не всегда возможно, кровь нужно отцентрифугировать сразу после взятия, и посылать в лабораторию плазму или сыворотку, замороженную при –20^оС, а лучше на сухом льду. Не следует посылать в лабораторию цельную кровь, даже с антикоагулянтом. До сих пор продолжаются дискуссии, какой материал лучше исследовать – плазму или сыворотку. Общепринятое мнение, что лучше плазму. В плазме более достоверно определяется общий белок и А/Г-индекс. Однако, для получения плазмы необходимо добавить антикоагулянт – чаще всего добавляют литиевый или натриевый гепарин. Это, в свою очередь, вызывает ложное понижение концентрации общего кальция крови, причем довольно значительное. Так, наши исследования показывают, что при использовании отечественного натриевого гепарина, эта погрешность составляет почти 1 ммоль/л, но даже при использовании литиевого гепарина погрешность может составлять до 0,4 ммоль/л (Васильев, 2002). Учитывая, что нижняя граница нормы общего кальция у игуан составляет около 2 ммоль/л, такая погрешность достаточна для постановки ложного диагноза. В связи с этим мы предпочитаем работать с сывороткой, если необходимо установить «почечные» параметры (кальций, фосфор, общий белок, мочевую кислоту) или с плазмой, если нас интересуют «печеночные» параметры (трансаминазы, ЛДГ, КФК, ГГТ). Если же мы планируем проводить электрофорез плазмы, то в качестве антикоагулянта используется ЭДТА. Данные Finkelstein, et al (2003), специально сравнивавших результаты парных биохимических исследований сыворотки и плазмы крови игуан показали, что, хотя при этом имеются достоверные различия, они не настолько значительны, чтобы повлиять на постановку диагноза. По их данным в плазме крови игуан уровни общего белка, альбуминов, глобулинов и АСТ были более высокими, а в сыворотке был выше уровень АЛТ. При сравнении парных образцов плазмы и сыворотки от обыкновенных удавов, в сыворотке был выше уровень КФК. Авторы полагают, что выбор образца не принципиален для биохимического исследования, за исключением того, что из одинакового объема крови получается больше плазмы, чем сыворотки. Поэтому у мелких или ослабленных ящериц из образца крови лучше сепарировать плазму. Уровень некоторых биохимических показателей особенно зависим от всевозможных артефактов. Можно выделить несколько главных.

- Гемолиз возникает при стоянии цельной крови или использовании тонких игл и сильного давления при переливании крови в пробирки и вакутайнеры. По данным Benson, et al (1999) умеренный гемолиз крови, взятой от здоровых игуан, вызывал значительное повышение уровня фосфора. Сильный гемолиз вызывал повышение уровней фосфора, калия, общего белка и АСТ. Как это ни странно, уровень кальция, мочевой кислоты и КФК не изменялся. Это конфликтует с данными других исследований (Mader, Rosental, 1998), показывающих, что в крови в случае гемолиза уровень КФК может повышаться почти в 10 раз, а также существенно понижается уровень кальция (в 1,5 раза) и глюкозы (в 2 раза). Наши данные лучше соотносятся с результатами последних авторов. Так или иначе, если после центрифугирования сыворотка или плазма имеет красноватый оттенок, такой образец лучше вообще не использовать или исключить из протокола исследований перечисленные выше параметры.

- При грубо выполненной венепункции в образце повышаются уровни АСТ, КФК и мочевой кислоты из-за сильного загрязнения тканевой жидкостью. Уровень КФК может также значительно возрастать, если кровь берут в конце осмотра после болезненных манипуляций или продолжительной фиксации пациента.

- Разбавление крови лимфой при слепой венепункции вызывает снижение общего белка, гематокрита и количества эритроцитов. Чаще всего это происходит при пункции венозных синусов (копчикового и постзатылочного) и вен плеча и голени из расположенных поблизости крупных лимфатических резервуаров. При этом при аспирации в шприц сначала втягивается прозрачная жидкость.

- Замораживание быстро сепарированной плазмы или сыворотки даже при –15 – 20°С не приводит, по нашим данным, к существенным артефактам.

Таким образом, большинство артефактов вызывает ложное повышение уровней фосфора, мочевой кислоты и КФК, а также ложное понижение общего кальция. Выраженные артефакты искусственно увеличивают уровень калия – в итоге мы можем наблюдать ложный биохимический профиль, характеризующий патологию почек. На это нужно делать скидку, считая кальций в анализе несколько более высоким, а фосфор – низким. Интерпретировать повышенные значения КФК вообще нужно с большой осторожностью. Любой анализ, вызывающий у врача сомнение, лучше повторить через 2-3 дня. Не раз в нашей практике КФК, повышенная до 3-5 тыс. ЕД/мкл, через 2 дня давала вполне умеренный уровень.

Наиболее распространенные методы определения общего кальция крови в клинической лабораторной практике – абсорбционная спектрофотометрия и колориметрические методы с о-крезолфталеином или arsenazo III. С помощью этих методов невозможно отделить связанный кальций от общего. Соответственно, при обычном биохимическом исследовании определяется только общий кальций в сыворотке (или плазме) крови. Так как уровень общего кальция в большой степени зависит от его связанной с белками фракции, для коррекции данных предложено несколько формул, учитывающих влияние альбуминовой фракции и общего белка на результаты исследований. Например, для собак принята формула:

Коррекция кальция = Общий Са (мг/дл) – альбумины (г/дл) + 3,5

Мы не обнаружили корреляций с этой формулой при исследовании крови игуан, однако, в принципе, построить уравнение регрессии не сложно, имея около 200 измерений свободного и связанного кальция крови.

Более стабильна и менее зависима от артефактов фракция свободного ионизированного кальция. Собственно, именно она является биологически активной и более ценной с позиций клинической диагностики. Для определения ионизированной фракции требуются специальные методы взятия и исследования материала. Для того чтобы уменьшить ошибку, вызванную артефактами, кровь берут в анаэробных условиях и охлаждают до +4°С, после чего применяют селективные для ионов кальция электроды. У теплокровных животных факторы, влияющие на уровень белка, не влияют на ионизированный кальций. В медицинской практике тест на ионизированный кальций является рутинным методом и возможно, врачам, работающим с рептилиями, лучше договариваться с медицинскими лабораториями. В США фирма HESKA продает стандартные панели (i-STAT, Waukesha, WI 53188) для определения газов крови, КЩС и ионизированного кальция по цене 10$ за панель. Они пригодны даже для «домашнего» использования. Сейчас с ними работают врачи в полевых условиях. Поскольку пока они адаптированы только для проведения исследований у человека и нескольких видов домашних животных, их применение для рептилий и интерпретация результатов требует осторожности и больше первичной информации.

Биохимический профиль интерпретируется у ящериц также как и у других животных. Клиническое значение биохимических показателей обсуждается в разделах, посвященных диагностике конкретных заболеваний. Поэтому в данном разделе будут просто приведены значения основных биохимических показателей крови игуан, основанные на данных разных авторов и результатах собственных исследований (см. таблицу ).

Таблица.. Нормальные биохимические показатели крови игуан (по данным разных авторов и на основании собственных исследований).

Показатель	♂♂	♀♀	По нашим данным
Натрий (ммоль/л)	159±4,7	161,2±4,3	152-164
Калий (ммоль/л)	4,2±1,1	3,3±1,2	2,5-4,2
Хлор (ммоль/л)	120±4	119±3	120-130
Кальций (мг/дл) (ммоль/л)	11,2±1,1 2,79±0,27	12±0,7 2,99 ± 0,17	7,21-13,23 1,8-3,3
Фосфор (мг/дл) (ммоль/л)	6,1±1,7 1,97± 0,55	7,3±1,5 2,36± 0,48	4,65-8,36 1,5-2,7
Мочевая кислота (мг/дл) (ммоль/л)	2,2±0,8 130±47	4,3±2,3 256±137	0,49-3,19 29-190
Креатинин (мг/дл) (мкмоль/л)	0,4±0,2 35±17,6	0,3±0,2 26,5±17,6	0,1-0,25 9-22
Азот мочевины, BUN (мг/дл) Мочевина (ммоль/л)	0,5±0,4 0,38±0,3	0,6±0,1 0,46±0,08	0,26-6,58 0,2-5
Глюкоза (мг/дл)	159,5±38,6 8,85±2,14	152,6±31,6 8,47±1,75	143-219,8 7,94-12,2
Общий белок (г/дл)	5,2±0,9	6,5±0,5	3,2-6,6
Альбумины (г/дл)	1,7±0,3	2,2±0,3	1,8-3,5
Глобулины (г/дл)	3,5±0,7	4,3±0,5	3,2-5,5
А/Г-индекс	0,5±0,1	0,5±0,1	0,5-0,9
Холестерол (мг/дл)	171,5±47,5 4,43±1,23	262,5±38,1 6,79±0,99	96,65-193,3 2,5-5,0
Триглицериды (ммоль/л)	-	-	1,0-1,8
ЛДГ (ЕД/л)	-	-	12-1800
АЛТ (ЕД/л)	37,4±29,4	44,1±32,7	5-30
АСТ (ЕД/л)	39,5±16,3	50,1±39,5	5-52
ГГТ (ЕД/л)	-	-	0-0,3
ЩФ (ЕД/л)	44,7±24,3	55,6±20,3	22-180
Общий билирубин (мг/дл)	1,1±0,8 18,8±13,68	1,3±1,3 22,23±22,23	-
КФК (ЕД/л)	-	-	88-1245
Желчные кислоты (мкмоль/л)	Голодные: 7,5	Сытые: 32-33	-
Т3 (пкг/дл)	-	-	42-53
Т4 (мкг/дл)	-	-	1,9-2,3