5.10. Гібридомна технологія для одержання моноклональних антитіл. Напрямки використання моноклональних антитіл

Лімфоїдні гібридоми - це безсмертні клітинні клони, що продуцюють антитіла однієї специфічності (моноклональні). Гібридоми одержують за допомогою злиття ракової клітини лімфоїдного ряду й «нормального» зрілого лімфоцита. Від ракової клітини гібридому успадковує здатність до необмеженої проліферації, а від «нормального» лімфоцита - здатність синтезувати антитіла. Гібридоми синтезують на основі банку клітин-носіїв (ліній ракових клітин), клон лімфоцитів, у принципі, можна одержати практично на будь-який антиген, що цікавить. На даний момент у світі існує більше 50 тис. гібридом. Отримані гібридоми на основі клітин мишей, пацюків, золотавого й китайського хом'ячків, клітин людини й т.д. Спочатку були отримані гібридоми на основі клітин миші лінії balb/c, технологія одержання яких була розроблена раніше. У цей час банк гібридом поповнюється за допомогою одержання гібридом на дослідників, що цікавлять, антигени. Гібридомна технологія на даному етапі є єдиною технологією, що дозволяє одержувати моноклональні антитіла в необхідній кількості, і займає провідне місце в комерційному обороті продуктів біотехнології.

  Технологія лімфоїдних гібридом була розроблена в 1975 році Мільштейном і Келером, і вже до 1977 року ними було отримано 16 типів гібридом, що синтезують різні типи моноклональних антитіл. Спочатку гібридомна технологія будувалася на основі наступних розробок: були лінії міеломних клітин мишей balb/c (дефектні по деяких ферментах метаболізму нуклеїнових кислот, що було необхідною умовою для селекції одержуваних гібридом), отримані в результаті розвитку методів одержання міелом, за допомогою введення інертного пластику й мінеральних масел у вигляді підшкірних ін'єкцій мишам; розроблені методи злиття клітин за допомогою вірусів (вірус Сендай) і поліетиленгліколю; розроблені методики виборчої селекції клітин за допомогою середовища ГАТ. Головною заслугою Мільштейна й Келера стала безпосередньо розробка методики, а також можливість використання одержуваних гібридом для широкомасштабного виробництва моноклональних антитіл. Можливості гібридомної технології були оцінені по достоїнству, і в 1984 році Келер і Мільштейн були визнані гідними Нобелівської премії. У наступні роки були отримані інші лінії клітин-носіїв, у тому числі й лінії клітин людини, однак найпоширенішим типом гібридом є гібридоми на основі мишачих клітин. Варто помітити, що, незважаючи на величезну практичну значимість гібридомна технологія вирішила й ряд теоретичних труднощів, зокрема це був остаточний і, імовірно, самий вагомий довід на користь клонально -селективної теорії синтезу антитіл.

Лімфоїдні гібридоми - це безсмертні клітинні клони, що продуцюють антитіла однієї специфічності (моноклональні). Гібридоми одержують за допомогою злиття ракової клітини лімфоїдного ряду й «нормального» зрілого лімфоцита. Від ракової клітини гібридому успадковує здатність до необмеженої проліферації, а від «нормального» лімфоцита - здатність синтезувати антитіла. Гібридоми синтезують на основі банку клітин-носіїв (ліній ракових клітин), клон лімфоцитів, у принципі, можна одержати практично на будь-який антиген, що цікавить. На даний момент у світі існує більше 50 тис. гібридом. Отримані гібридоми на основі клітин мишей, пацюків, золотавого й китайського хом'ячків, клітин людини й т.д. Спочатку були отримані гібридоми на основі клітин миші лінії balb/c, технологія одержання яких була розроблена раніше. У цей час банк гібридом поповнюється за допомогою одержання гібридом на дослідників, що цікавлять, антигени. Гібридомна технологія на даному етапі є єдиною технологією, що дозволяє одержувати моноклональні антитіла в необхідній кількості, і займає провідне місце в комерційному обороті продуктів біотехнології.

 Технологія лімфоїдних гібридом була розроблена в 1975 році Мільштейном і Келером, і вже до 1977 року ними було отримано 16 типів гібридом, що синтезують різні типи моноклональних антитіл. Спочатку гібридомна технологія будувалася на основі наступних розробок: були лінії міеломних клітин мишей balb/c (дефектні по деяких ферментах метаболізму нуклеїнових кислот, що було необхідною умовою для селекції одержуваних гібридом), отримані в результаті розвитку методів одержання міелом, за допомогою введення інертного пластику й мінеральних масел у вигляді підшкірних ін'єкцій мишам; розроблені методи злиття клітин за допомогою вірусів (вірус Сендай) і поліетиленгліколю; розроблені методики виборчої селекції клітин за допомогою середовища ГАТ. Головною заслугою Мільштейна й Келера стала безпосередньо розробка методики, а також можливість використання одержуваних гібридом для широкомасштабного виробництва моноклональних антитіл. Можливості гібридомної технології були оцінені по достоїнству, і в 1984 році Келер і Мільштейн були визнані гідними Нобелівської премії. У наступні роки були отримані інші лінії клітин-носіїв, у тому числі й лінії клітин людини, однак найпоширенішим типом гібридом є гібридоми на основі мишачих клітин. Варто помітити, що, незважаючи на величезну практичну значимість гібридомна технологія вирішила й ряд теоретичних труднощів, зокрема це був остаточний і, імовірно, самий вагомий довід на користь клонально-селективної теорії синтезу антитіл.

Гібридомна технологія, у її класичному варіанті, виконується в кілька етапів. Як передумови, необхідно мати лінію ракових клітин-носіїв, дефектних по одному з ферментів (тимідинкіназі (ТК) або гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансферазі (ГГФРТ)), що саме по собі визначає вибір способу селекції, що утворюється гібридом; розроблену процедуру злиття клітин; антиген, антитіла на який необхідно одержати дослідникові, методики визначення продуцуємих гібридомой антитіл з метою клонування необхідної лінії. При наявності всього перерахованого вище процедура одержання лімфоїдних гібридом виглядає в такий спосіб (рис 1):

1. імунізація тварин обраним антигеном і виділення «нормальних» лімфоцитів імунізуємої тварини після визначення максимального титру антитіл, що цікавлять дослідника,;

2. культивування ракових клітин-носіїв;

3. проведення злиття клітин-носіїв з «нормальними» лімфоцитами (у класичному варіанті за допомогою полиэтиленгликоля);

4. одному з перерахованих ферментів (ТК або ГГФРТ), не здатні рости в ГАТ середовищу, що містить гипоксантин, тимидин і аминоптерин. Аминоптерин блокує синтез dTMP за допомогою ингибирования дигидрофолят-редуктазы.

Клітини, що мають дефект по одному з перерахованих ферментів (ТК або ГГФРТ), не здатні рости в ГАТ середовищі, що містить гіпоксантин, тимідин і аміноптерин. Аміноптерин блокує синтез dTMP за допомогою інгібування дигідрофолят-редуктази. Отже, у середовищі, що містить аміноптерин, синтез піримідинів може відбуватися тільки з готових попередників (з тимідину в цьому випадку). Клітини, що містять дефектну ТК не здатні рости в ГАТ середовищі. Клітини, що містять дефектну ГГФРТ, здатні синтезувати пурини з попередників, але не з готових продуктів (з гіпоксантину в цьому випадку), отже, у Гат-середовищі дані клітини загинуть. У тому випадку, якщо відбудеться злиття клітин таким чином, що в отриманих гібридів дефектні ГГФРТ і ТК будуть доповнені функціональними ферментами, то дані гібриди виживуть у Гат-середовищі.