Оценка количества спермы по времени обесцвечивания метиленовой синьки (мин) часть II

Количество спермы	Бык	Баран
Хорошее	5-10	3-7
Среднее	11-30	8-12
Плохое	Более 30	Более 12

Определение концентрации спермиев

Глазомерная оценка спермы по густоте даст приблизительное представление о фактическом количестве спермиев в 1 мл спермы, что не обеспечивает рационального использования ее, не позволяет определить точную степень разбавления, а следовательно нормировать количество спермиев в дозе.

Для точного определения количества сперматозоидов в еденице объема и в эякуляте пользуются методом прямого подсчета в счетных камерах с сетками Горяева, Бюркера, Тома. Принцип их одинаков. В камере Горяева имеется две сетки, состоящие из 225 больших квадратов, из них 25 (по 5 в ряду) на 16 маленьких. Площадь одного маленького квадратика равна 1/400 мм² , а объем 1/4000 мм³.

Перед зарядкой камеры сперму разбавляют 3 % р-ром NaCl (разбавитель одновременно убивает спермиев). Разбавление проводят в меланжерах.

Степень разбавления спермы для подсчета

Сперма	Смеситель	До какой метки набирают		Степень разбавления
		сперму	раствор
Баран	эритроцитарный	0,5	101	200
Бык		1,0	101	100
Хряк	лейкоцитарный	0,5	11	20
Жеребец		0,5	11	20

Притирается к камере покровное стекло, затем из меланжера удаляется 3-4 капли и затем наносят под покровное стекло на каждую сетку по одной капле. Капля должна равномерно заполнить полость под сеткой и не иметь пузырьков воздуха. Подсчет проводят в 80 малых квадратах, при этом считают спермии, головки которых находятся внутри квадрата и на левых и верхних краях.

Концентрацию подсчитывают по формуле:

С – концентрация спермиев;

П – число подсчитанных;

Д – степень разбавления;

N – число квадратов (малых);

Р – глубина камеры (мм).

Определение концентрации спермы методом стандартов. Основан на оценке степени прозрачности спермы. Спермии менее прозрачны, чем плазма, от их концентрации зависит прозрачность спермы. Эти методы менее точны, т.к. на прозрачность спермы кроме спермиев оказывают влияние и другие факторы (красящие свойства кормов, эпителиальные клетки и т.д.).

Для определения концентрации спермы жеребца Паршутин Г.В. и Румянцева Е.Ю. предложили метод стандартов, состоящий из 6 небольших запаяных пробирок с прозрачной жидкостью, соответствующей степени прозрачности и определенной концентрации спермиев. К ним прилагается пробирка, в которую наливают 1,5-2 мл спермы. Встряхнув стандарты, подбирают один из них сходный по прозрачности с исследуемой спермой.

Стандарт С.И. Сердюка предложен для определения концентрации спермы хряка. Состоит из одной запаянной пробирки, прозрачность которой соответствует концентрации спермы 5 млн/мл. В пустую пробирку наливают 1 мл. 1 % р-ра NaCl + 0,1 мл спермы. Встряхивают, сравнивают со стандартом, а затем доливают 1% р-ром NaCl до тех пор, пока прозрачность в обеих пробирках не станет одинаковой. Затем определяют концентрацию по формуле:

К= 50 (Н+0,1), Н – объем добавленного 1% р-ра NaCl.

Фотоэлектрокалориметрический метод определения концентрации спермы основан на способности мутной жидкости со взвешенными частицами поглощать свет прямо пропорционально числу этих частиц. Степень поглощения пропускаемого через исследуемую жидкость светового пучка определяется в фотоэлектрокалориметре (ФЭК). Для определения концентрации на ФЭК сначала строят калибровочную кривую. Для этого берут пробы спермы с различной концентрацией спермиев и устанавливают в ФЭК их оптическую плотность, по которой в дальнейшем судят о концентрации спермиев в исследуемых пробах. Построенную градуированную кривую следует ежемесячно проверять, т.к. показания прибора могут изменятся из-за старения фотоэлемента.

Также предложены методы подсчета спермиев по величине их электрического сопротивления; подсчет спермиев в сперме на скоростном автоматическом счетчике клеток – целлоскопе; подсчет с использованием люминесцентных красителей и радиоактивных протонов.

Определение процента живых спермиев

Глазомерная оценка по активности субъективна, поэтому В.А. Морозов предложил пользоваться окрашиванием спермы водными растворами эозина. Живые и активные спермии не окрашиваются, а мертвые и с колебательными движениями воспринимают окраску. Техника в следующем:

- на обезжиренное стекло капают каплю спермы + каплю 5 % р-ра эозина;

- перемешивают и делают тонкий мазок;

- высохший мазок просматривают под микроскопом. Мертвые спермии окрашиваются в розовый цвет. Подсчитывают 500 спермиев.

Определение процента патологических форм

Даже в нормальной по качеству сперме есть некоторое количество патологических форм. Обнаруживаются гигантские и карликовые спермии, с деформацией головки, с двумя головками, с подломом шейки, двухвостые, с закрученным хвостом и т.д.

Большое количество анормальных спермиев в сперме указывает на нарушение спермиогенеза, вредное влияние секретов придаточных половых желез или на нарушение правил получения и хранения спермы. Большое значение в образовании патологических форм спермиев имеет нарушение терморегулирующие функции мошонки.

Техника определения состоит в следующем:

– на протертое предметное стекло наносят каплю спермы;

– делают мазок, сушат на воздухе и фиксируют в 96⁰ спирте, который наносят пипеткой;

– ополаскивают водой, окрашивают раствором фуксина, метиленовой краской и др. красителем – 3-5 мин;

– краску смывают водой, мазок сушат и ведут подсчет при увеличении 400-600 раз;

– подсчитывают 600 спермиев, учитывая нормальные и патологические формы в нескольких полях зрения и исчисляют процент патологических форм спермиев.