46. Клітинна інженерія. Культура калусних клітин. Мікроклональне розмноження.

Клітинна інженерія — метод конструювання клітин нового типу на основі їх культивування, гібридизації та реконструкції. За допомогою клітинної інженерії вдається поєднати геноми різних видів (навіть тих, що належать до різних царств). Клітинну інженерію використовують для вирішення багатьох теоретичних проблем біології, промислової мікробіології, а також біотехнології, наприклад, використання гібридом для отримання моноклональних антитіл, які використовують у медицині та інших галузях науки і виробництва.

Історично клітинна інженерія пройшла наступні етапи:

1) розробка методів штучного злиття клітин, що ростуть в культурі;

2) отримання реконструйованих клітин шляхом злиття – об’єднання ядра та цитоплазми від різних клітин у раніше невідомих комбінаціях;

3) ефективна трансфекція соматичних та статевих клітин. У завдання клітинної інженерії входить створення визначеними методами гібридних клітин.

Розрізняють наступні гібридні клітини:

1) Типові гібридні клітини: гетерокаріон – це гібридна клітина, яка містить у своїй цитоплазмі два або декілька різних чи однакових ядер. Гетерокаріони не діляться; синкаріон – це гібридна клітина, в якій пройшло об’єднання хромосом різних клітин в одне ядро. Синкаріон часто дає початок проліферуючому клітинному клону.

2) Особливі типи гібридних клітин:. а) гібридна клітина, що включає в себе каріопласт (ядро, оточене тонким шаром цитоплазми) + цитопласт (без’ядерна цитоплазма); б) цибрид — гібридна клітина, що включає в себе цілу клітину + цитопласт іншої клітини; в) каріобрид — гібридна клітина, що включає в себе цілу клітину + каріопласт іншої клітини

Культура калусних клітин:

Калусні клітини – це дедиференційовані клітини, в які перетворюються спеціалізовані і меристематичні клітини при їх культивуванні на специфічних поживних середовищах ін вітро. Калусна тканина має вигляд аморфної маси тонкостінних паренхімних клітин без визначеної анатомічної структури. Клітини калусу мають велике ядро, високий вміст ДНК і РНК; деякі клітини здатні накопичувати крохмаль і речовини вторинного метаболізму. Колір тканин може бути білим, жовтим, зеленкуватим, червонуватим, що залежить від виду рослини, типу експланта, умов культивування. Калусні клітини можна невизначено довго вирощувати ін вітро. Для цього необхідні періодичні пересадки (пасажі) невеликої частини утворених клітин на свіже поживне середовище через кожні 3-4 тижні. Найбільш «старим» вважають штам клітин, одержаний з коренеплоду моркви Роже Готре ще у 1938 році і який по сьогоднішній день вирощують у багатьох лабораторіях світу. Для індукції калусоутворення стерильні експланти (листки, черешки, сегменти стебел, корінців тощо) нарізують і поміщують на поживне середовище з високим значенням співвідношення ауксин/цитокінін: ауксину в середовищі повинно бути у 5-10 разів більше, ніж цитокініну. Перехід спеціалізованих клітин у стан неорганізованого росту пов’язаний із синтезом білка в клітинах, збільшенням вмісту РНК, зникненням хлоропластів і хромопластів. При оптимально підібраному середовищі сегменти утворюють калус через 3-8 тижнів.

Мікроклональне розмноження - це масове безстатеве розмноження в культурі in vitro, при якому отримані рослини ідентичні до вихідної батьківської форми. Від традиційних методів розмноження рослин воно відрізняється такими особливостями: 1) отриманням великої кількості копій з мінімальної кількості вихідного матеріалу; 2) отриманням, залежно від мети дослідження, як генетично однорідного матеріалу, так і сомаклональних варіантів; 3) можливість відбирати in vitro рослинний матеріал з ознаками, що цікавлять дослідника; 4) можливість отримання безвірусного посадкового матеріалу при використанні як експланта апікальних меристем та проведення при необхідності термотерапії in vitro; 5) можливість проводити розмноження рослин протягом року, оскільки їх ріст та розвиток in vitro практично не залежать від сезонних змін. Вперше мікроклональне розмноження було здійснено вченим Морелем (1960) при дослідженні орхідей Сутbidium. Мурасіге розділив весь процес мікроклонального розмноження на три стадії: 1) ініціація асептичної культури; 2) індукція численних пагонів при повторних пасажах на середовище для розмноження; 3) підготовка сформованих in vitro рослин до висадки в грунт. У цілому, метод мікроклонального розмноження ґрунтується на індукованому цитокінінами розростанні верхівкових і пазушних меристем, кожна з яких дає початок багатьом пагонам. Після формування багатьох пагонів, їх розділяють на менші групи пагонів, переносять на свіже середовище, і процес повторюється. Основними факторами, що впливають на процес мікроклонального розмноження, є тип експланту, склад поживних середовищ і умови культивування. У більшості випадків для мікроклонального розмноження використовують різноманітні модифікації середовища Мурасіге, Скуга, хоча деякі групи рослин можуть мати індивідуальні потреби в поживних речовинах. Культури можуть рости на агаризованих або на рідких поживних середовищах на мостиках із фільтрувального паперу. Методика мікроклонального розмноження Швидке мікроклональне розмноження включає декілька етапів. 1. Індукція адвентивних бруньок. 2. Формування пагонів. 3. Вкорінення пагонів та формування рослин. Розмноження рослин шляхом вичленення апікальної меристеми 1. Готують поживне середовище Мурасіге, Скуга. 2. Вичленення меристеми проводять у боксі з ламінарним потоком повітря. 3. Висадка і вирощування. 4. Вирощені із меристеми рослини в стерильних умовах виймають із пробірок і живцюють таким чином, щоб кожний із живців мав точку росту.