Алгоритм постановки реакции преципитации в геле

I. Противодифтерийную антитоксическую сыворотку разводят так, чтобы в 1мл содержалось 500 АЕ (антитоксических единиц). Стерильным пинцетом вынимают из пакетика одну полоску фильтровальной бумаги и укладывают её в половинку стерильной чашки Петри. Стерильной пипеткой набирают 0,25 мл разведенной сыворотки (I25 АЕ) и смачивают полоску бумаги (сверху вниз).

2. В чашку Петри с 20% сывороточным агаром накладывают строго посередине смоченную полоску фильтровальной бумаги, слегка прижимая её пинцетом к поверхности среды.

3.Исследуемые культуры засевают в виде «бляшек» с обеих сторон фильтровальной бумаги на расстояние 0,5-0,7 см от края полоски бумаги, помещая их между двумя бляшками заведомо токсигенного штамма. Бляшки наносят на равном расстоянии одну от другой, величиной 0,8-1 см в диаметре. Заканчивают посев двумя бляшками токсигенного штамма.

4.Посев инкубируют при +37°С 24 часа.

Примечание: необходимо строго соблюдать последовательность внесения инокулята (бляшки «токсигенной» культуры→ бляшки исследуемой культуры→ бляшки «токсигенной» культуры→ бляшки исследуемой культуры и т. д.).

Учет результатов:

а) Реакция считается положительной, если линии (полосы) преципитации исследуемой культуры четкие и сливаются (плавно переходят) с линиями преципитации контрольного (токсигенного) штамма. Положительный результат реакции свидетельствует о токсигенности выделенной культуры.

б) Реакция считается отрицательной, если линии преципитации исследуемой культуры не доходят до линий преципитации контрольного штамма или, если они перекрещивается с ними или, если они вообще отсутствуют. Отрицательный результат реакции свидетельствует о нетоксигенности выделенной культуры.

18. Поставить реакцию пассивной Vi-гемагглютинации, учесть результат по демонстрационной реакции и сделать заключение. Указать, с какой целью проводится постановка данной реакции.

Разведения сыворотки/ Ингредиенты в мл	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640	1:1280		КД	КД
ИХН	0,9	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5		0,5	0,5
Сыворотка обследуемого	0,1 → 0,5 → 0,5 → 0,5 → 0,5 → 0,5 → 0,5 → 0,5 - - ↓ 0,5 в дез. р-р
Ви-диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25		0,25	0,25
	Планшет осторожно встряхивают и ставят на 2 часа в термостат при 370С или на ночь при комнатной температуре
Результат

Примечание: В качестве обязательных контролей служит:

1) постановки реакции с адсорбированной монорецепторной Ви-сывороткой, прилагаемой диагностикуму;

2) проверка отсутствия спонтанной агглютинации диагностикума (2 контроля «КД»).

2. Возьмите сыворотку обследуемого и эритроцитарный сальмонеллезный Vi-диагностикум и поставьте Vi -РНГА.

3. Проведите учет Vi -РНГА и выпишите ответ.

а) Учет реакции проводится по четырехкрестной системе:

++++ – эритроциты равномерно устилают почти все дно лунки, изредка наблюдается картина «зонтика».

+++ – почти все эритроциты агглютинированы и равномерно покрывают дно лунки. На этом фоне имеется малозаметное кольцо из осевших неагглютиниро-ванных эритроцитов.

++ – наряду с равномерным агглютинатом на дне лунки имеется осадок из неаг-глютинированных эритроцитов в виде маленького колечка или «пуговки».

+ – большинство эритроцитов не агглютинировано и осело в центре дна лунки. Наряду с этим небольшое количество агглютинированных эритроцитов осело в виде маленьких хлопьев вокруг центра дна лунки.

– – признаков агглютинации нет. Эритроциты осели в виде маленького колечка или «пуговки» в центре дна лунки, они имеют малый размер и совершенно ровные края.

б) Учет реакции начинают с контролей. Результаты, полученные в РНГА, можно считать достоверными лишь в том случае, если с прилагаемой иммунной сывороткой получен положительный результат не ниже, чем до титра 1:160, а в «КД» отсутствует спонтанная агглютинация диагностикума.

в) Титром антител исследуемой сыворотки считается последнее разведение сыворотки, которое еще дает ярко выраженную агглютинацию эритроцитов не менее, чем на 3+.

г) Условно-диагностическим титром для Vi - антител является положительный

результат в разведении 1:80 - 1:100. В динамике должно быть 4-х кратное увеличение титра антител у больных брюшным тифом. Лица, в сыворотках которых обнаруживаются Ви-гемагглютинины в титре 1:40 рассматриваются как подозри-тельные на хроническое брюшнотифозное бактерионосительство и подлежат углубленному бактериологическому обследованию, т.к. диагноз не может быть поставлен только на основании серологического исследования.

19. Охарактеризовать принцип и методику иммунохроматографии для обнаружения микроорганизмов в исследуемом материале.

Принцип метода иммунохроматографии(ИХА) - это метод определения наличия определенных концентраций веществ в биологических материалах (моча, цельная кровь, сыворотка или плазма крови, слюна, кал и т.д.).

Данный вид анализа осуществляется при помощи индикаторных полосок, палочек, панелей или тест-кассет, которые обеспечивают быстроту проведения тестирования. ИХА – сравнительно молодой метод анализа, он часто обозначается в литературе также как метод сухой иммунохимии, стрип-тест, QuikStrip cassette, QuikStrip dipstick, экспресс-тест или экспресс-анализ. Эти названия связаны с быстротой проведения этого метода анализа.

Принцип действия иммунохроматографического теста состоит в том, что при погружении теста в физиологическую жидкость она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Подвижной фазой в данном случае является физиологическая жидкость. Вместе с жидкостью движутся и антитела с красителем. Если в этой жидкости присутствует исследуемый антиген (гормон, инфекционный или онкологический маркер), то происходит его связывание, как с первым, так и со вторым типом антител, что является уже иммунологическим методом анализа. При этом происходит накопление антител с красителем вокруг антител, жестко иммобилизованных в тест-зоне ИХА-полоски, что проявляется в виде яркой темной полосы. Несвязавшиеся антитела с красителем мигрируют далее вдоль полоски и неизбежно взаимодействуют со вторичными антителами в контрольной зоне, где и наблюдается вторая темная полоса. Взаимодействие (и темная полоса) в контрольной зоне должны проявляться всегда (если анализ проведен правильно), независимо от присутствия исследуемого антигена в физиологической жидкости (см.рис.1). Результаты определяются визуально или компьютерной обработкой отсканированного изображения.

Иммунологический метод анализа основан на реакции между антигеном и соответствующим ему антителом. Антиген - это вещество, которое чужеродное для организма человека и которое может запустить иммунную систему (защитную реакцию). Антитела - это белки, которые выделяются клетками нашего организма при внедрении в него антигена. Метод имунной хроматографии основан на особенном свойстве антител связываться с антигеном специфическим (то есть избирательным) образом. Это означает, что каждое антитело узнает и связывается только с определенным антигеном. На этой уникальной особенности антител и основаны все иммунологические методы анализа, в том числе и ИХА. Причем определяемым «антигеном» в данном методе анализа может служить и определяемое в биоматериале антитело к инфекционному агенту или аутоантитело, тогда остальные используемые в тесте антитела будут являться антиантителами.

В ИХА- тестах используется три типа антител:

1. Растворимые моноклональные антитела к исследуемому антигену или антителу, конъюгированные ("сшитые") с коллоидным золотом - красителем, который можно легко идентифицировать даже в самых малых концентрациях. Эти антитела нанесены вблизи участка погружения тест-полоски в физиологическую жидкость (мочу, кровь).

2. Поликлональные антитела к исследуемому антигену или антителу, жестко иммобилизованные в тест-зоне полоски.

3. Вторичные антитела к моноклональным антителам, жестко иммобилизованные в контрольной зоне тест-полоски.

Принцип работы тестов на наркотики несколько отличается от других тест-систем. Устройство ИХА-полоски отличается тем, что в тест-зоне иммобилизованы искусственные антигены, способные специфически связываться со свободными антителами. Если исследуемый антиген (наркотик) не присутствует в физиологической жидкости, участки связывания антител (эпитопы) остаются свободными, и они способны связываться с искусственными антигенами в тест-зоне, образуя темную полосу за счет конъюгированного красителя. Соответственно если исследуемый антиген присутстствует в жидкости, то антитела, связавшись с ним, уже не могут взаимодействовать с антигенами в тест-зоне и образования темной полосы там не происходит. Но в обоих случаях (если анализ проведен правильно) происходит связывание "окрашенных" антител со вторичными антителами в контрольной зоне и образование там темной полосы. Возможные варианты при проведении анализа:

одна полоса - положительный результат, две полосы – отрицательный результат, нет полос - анализ проведен неправильно.

Основными преимуществами использования иммунохроматографических тест- полосок являются:

1) Простота и удобство - позволяет получить результат (анализ и первичное представление о причине заболевания) без оборудования и специальных навыков

2) Надежность - достоверность тестов достигает 92-99,8%, при этом каждый тест имеет встроенный внутренний контроль

3) Экономичность - минимальные затраты на приобретение теста и экономия времени на проведение обследования. В рознице стоимость одного ИФА-исследования в 5-10 раз дороже ИХА и получение результата минимум на следующий день

4) Анонимность - что особенно важно при выявлении заболеваний, передаваемых половым путем, других инфекционных заболеваний, а также выявлении фактов употребления наркотических веществ

5) Независимость - не требует предварительной медицинской консультации и рецепта врача.

Являясь эффективным средством диагностирования, экспресс-тесты позволяют визуально в течение нескольких минут определить и оценить содержание антигенов, антител, гормонов и других диагностически важных веществ в организме человека. Экспресс-тесты отличаются высокой степенью чувствительности и точности, обнаруживая более 100 видов заболеваний, включающих такие распространённые болезни как туберкулёз, сифилис, гонорею, хламидиоз, различные виды вирусных гепатитов, и др., а также всю гамму применяемых наркотических веществ при высокой достоверности определения. Важным преимуществом данного вида тестов является их применение в диагностике in vitro, не требующей непосредственного присутствия обследуемого пациента.

Однако иммунохроматографические тест-полоски не лишены недостатков. Касается это надежности, чувствительности и экономичности тестов. Надежность и чувствительность зависит, во-первых, от качества используемых в тесте моноклональных антител и, во-вторых, от концентрации антигена в биоматериале. Качество моноклональных антител зависит от способов их получения, очистки и фиксации на носителе. Концентрация антигена – от стадии заболевания и количества биоматериала. Количество биоматериала особенно важно при использовании цельной крови. При этом существенную роль играет гематокрит, т.е. соотношение плазмы и форменных элементов. При высоком гематокрите снижается количество плазмы с антигеном, мигрирующей вдоль полоски. Температура, от которой зависит скорость взаимодействие антитела с антигеном, важна только для времени постановки теста. Понятно, что использовать полоски при температуре ниже точки замерзания воды, составляющей основную часть биоматериала, не имеет смысла.

Вызывает большие сомнения экономичность использования экспресс-тестов в бюджетных медицинских организациях, которые занимаются массовой диспансеризацией населения и которым как раз-то удобны и необходимы комплексные стрип-системы из тест-полосок для скринингового выявления различных заболеваний. Обусловлено это низкой стоимостью анализа по бюджетным расценкам. При этом себестоимость тест-полоски в некоторых случаях в 10 раз превосходит оплату анализа.

20. Произвести забор материала для исследования на стафилококконосительство и сделать первичный посев данного материала на элективную пластинчатую среду.

Взятие исследуемого материала.

Материал из носовых ходов забирают с помощью сухого стерильного тампона, а из зева - с помощью увлажненного стерильного ватного тампона (0,9 % раствор NaCl). Мазки из носа и глотки берут разными тампонами. Материал из глотки и с миндалин следует забирать натощак или не ранее, чем через 3-4 часа после еды. При взятии мазков с задней стенки глотки и миндалин нельзя касаться тампоном языка, слизистой щек, зубов.

Материал должен быть доставлен в лабораторию в течение 2 часов. При использовании транспортной среды (сахарного бульона) время доставки увеличивается до 24 часов. В холодное время года отобранный материал следует оберегать от охлаждения.

Для обследования на стафилококковое бактерионосительство материал забирают из двух носовых ходов сухим ватным тампоном и сразу же засевают на питательные среды.

Оценка диагностической значимости полученных результатов.

Оценка этиологической значимости отдельных видов микроорганизмов осложняется обилием нормальной микрофлоры и широким распространением бактерионосительства. Нормальная микрофлора полости рта и глотки характеризуется высокой степенью разнообразия и включает Streptococcusspp., Neisseriaspp., Staphylococcusspp., Corynebacteriumspp., Lactobacillusspp., Candidaspp., и др. У лиц преклонного возраста и у людей с иммунодефицитами в ротоглотке возрастает количество грамотрицательных микроорганизмов, включая Escherichiacoli, Klebsiellaspp., Acinetobacterspp., Pseudomonasspp. и др. Широко распространено и бактерионосительство патогенных бактерий.

Среди инфекций бактериальной этиологии лидирующее положение занимают ангины. В этиологии бактериальных ангин ведущая роль принадлежит стрептококкам группы А: почти в 80% случаев ангины бактериальной этиологии вызывают Streptococcuspyogenes, 17,8% - стафилококки (самостоятельно или в ассоциации со стрептококками).

1. Из материала делают мазок, окрашивают, микроскопируют и делают предварительный ответ.

2. Материал засевают на чашку Петри с ЖСА→ 37оС 48 час, 5% кровяной агар → 37оС 24 часа.

3. Материал засевают в жидкую элективную среду для стафилококков – солевой бульон – тампоном методом «отмывания» → 37о на 24 часа.

21. Отобрать чашку с культурой St. aureus и провести выделение чистой культуры.

Оставшуюся часть этой же колонии пересевают на скошенный СПА для выделения и накопления чистой культуры. Ставят в термостат при 37^о 24 часа.

Проверяют однородность выделенной чистой культуры, т.е. делают мазок со скошенного СПА, окрашивают по Граму, микроскопируют, должны быть клетки однородные.

22. Поставить тест анаэробного сбраживания маннита культурой стафилококка. Учесть результат по демонстрационной пробе.

23. Поставить реакцию плазмокоагуляции для видовой идентификации стафилококков. Учесть результат по демонстрационной пробе.

Алгоритм постановки РПК:

1. Перед употреблением сухую цитратную плазму крови кролика растворяют в стерильном ИХН до объема, указанного на ампуле. Затем разводят плазму 1:5 стерильным ИХН (1мл растворенной плазмы + 4мл ИХН, или 2 мл плазмы + 8мл ИХН).

2. В 2 преципитационные (или серологические) пробирки вносят по 0,5 мл разведенной 1:5 плазмы стерильной пипеткой.

3. В одну пробирку вносят петлю 18-20-часовой чистой культуры стафилококка – это опыт. Вторая пробирка с незасеянной плазмой является контролем.

4. Обе пробирки инкубируют при 37о в течение 1-3 час. Учитывают предвари-тельный результат. Если коагуляция плазмы не происходит, их оставляют при комнатной температуре ещё на 18-24 час.

5. Учет: в контрольной пробирке плазма должна иметь жидкую консистенцию. В опытной пробирке реакция считается положительной независимо от степени свертывания плазмы (образуется сгусток или свертывается полностью, не выливается из перевернутой пробирки).

Результат: «Реакция плазмокоагуляции …….

24. Произвести забор материала с целью выделения патогенных стрептококков и сделать посев на жидкую элективную питательную среду.

1. Произведите забор материала (слизь из носоглотки) стерильным «кишечным» тампоном друг у друга, используя шпатель для языка.

2. Сделайте посев материала тампоном на сектор чашки Петри с 1% сахарным агаром и поставьте посевы в термостат при 37⁰С на 24 часа.

3.Сделайте посев материала тампоном методом «отмывания тампона» в пробирку с 1% сахарным бульоном или сывороточным бульоном, поставьте посевы в термостат при 37⁰С на 24 часа.

25. Провести первичные посевы испражнений с целью выделения энтеробактерий.

26. Отобрать чашку с культурой энтеробактерий и провести посев для выделения чистой культуры и ее первичной идентификации.

27. Определить биохимические свойства микроорганизмов по характеру их роста на коротком «пестром» ряду Гисса.

Практика

Приготовить препарат из агаровой культуры, выращенной в чашке Петри, окрасить по методу Грама-Синева, изучить под микроскопом и сделать заключение.	33
Приготовить препарат из мокроты, окрасить по методу Циля-Нильсена, изучить под микроскопом и сделать заключение.
Приготовить препарат из чистой культуры антракоидов, окрасить по методу Ожешко, изучить под микроскопом и сделать заключение.
Произвести забор материала (слизь из носа) стерильным тампоном, сделать мазок-отпечаток, окрасить щелочным метиленовым синим Леффлера, изучить под микроскопом и сделать заключение.
Приготовить нативный препарат «раздавленная капля» из агаровой культуры бактерий, изучить под микроскопом и сделать заключение.	34
Приготовить нативный препарат «висячая капля» из бульонной культуры бактерий, изучить под микроскопом и сделать заключение.
Провести определение подвижности микроорганизмов культуральным методом и сделать заключение по демонстрационному посеву.
Подготовить лабораторную посуду: чашки Петри, градуированные пипетки, пробирки, флаконы, – к стерилизации. Указать способы стерилизации посуды.
Приготовить «кишечный», «дифтерийный» и «заднеглоточный» тампоны, подготовить их к стерилизации и указать ее режим.	35
Правила приготовления дезинфицирующих растворов разной концентрации и сроки их использования. Тест-объекты для контроля дезинфекции. Провести профилактическую дезинфекцию рук по европейскому стандарту EN –1500.
Провести посев бульонной культуры на агар в чашке Петри штрихом на 2 сектора.	36
Провести посев культуры энтеробактерий, выделенной на дифференциально-диагностической пластинчатой среде, на среду Клиглера (Ресселя).
Пересеять чистую культуру на агар в чашке Петри штрихом на 4 сектора.
Провести посевы чистой культуры с целью изучения ее биохимических свойств.	37
Поставить пробу для определения чувствительности выделенной культуры к антибиотикам методом диффузии в агар с применением бумажных дисков. Произвести учет результатов по поставленной пробе и сделать заключение.
Поставить реакцию Видаля, учесть результат по демонстрационной реакции и сделать заключение.
Поставить реакцию преципитации в геле, учесть ее результат по демонстрационной чашке и сделать заключение.	38
Поставить реакцию пассивной Vi-гемагглютинации, учесть результат по демонстрационной реакции и сделать заключение. Указать, с какой целью проводится постановка данной реакции.
Охарактеризовать принцип и методику иммунохроматографии для обнаружения микроорганизмов в исследуемом материале.
Произвести забор материала для исследования на стафилококконосительство и сделать первичный посев данного материала на элективную пластинчатую среду.	39
Отобрать чашку с культурой St. aureus и провести выделение чистой культуры.	40
Поставить тест анаэробного сбраживания маннита культурой стафилококка. Учесть результат по демонстрационной пробе.
Поставить реакцию плазмокоагуляции для видовой идентификации стафилококков. Учесть результат по демонстрационной пробе.
Произвести забор материала с целью выделения патогенных стрептококков и сделать посев на жидкую элективную питательную среду.
Провести первичные посевы испражнений с целью выделения энтеробактерий.
Отобрать чашку с культурой энтеробактерий и провести посев для выделения чистой культуры и ее первичной идентификации.
Определить биохимические свойства микроорганизмов по характеру их роста на коротком «пестром» ряду Гисса.

41