Алгоритм посева на полиуглеводную среду:

1. На чашке Петри со средой Эндо (Левина, СПА) отбирают типичную изолированную колонию: обводят ее стеклографом со стороны дна чашки.

2. Чашку Петри берут в левую руку, а петлю - в правую; петлю фламбируют в пламени спиртовки; открывают крышку чашки и вводят под нее обожженную петлю и охлаждают ее о внутреннюю поверхность крышки; набирают посевной материал (не более 1/2 части колонии).

3. Вынимают петлю, закрывают чашку и ставят её в кювету, а в левую руку берут пробирку с полиуглеводной средой.

4. Снятую петлей с чашки Петри колонию осторожно, не задевая края пробирки, вносят в конденсационную жидкость среды Клиглера (Ресселя).

5. Затем сплошными штрихами засевают всю скошенную поверхность среды снизу вверх, а затем делают укол в глубину столбика. Укол следует производить в центр агарового столбика (для чего делают укол примерно от середины скошенной части среды), не доходя 3-4 мм до дна пробирки.

13. Пересеять чистую культуру на агар в чашке Петри штрихом на 4 сектора.

Алгоритм посева из пробирки в чашку Петри на 4 сектора:

1. Пробирку с посевным материалом (культурой) держат в левой руке, петлю - в правой. Петлю фламбируют, вынимают пробку, фламбируют края пробирки и вводят петлю через пламя спиртовки в пробирку, охлаждают, набирают немного материала (одну петлю), вынимают петлю из пробирки, фламбируют края пробирки и закрывают ее пробкой и ставят пробирку в штатив.

2. Левой рукой берут чашку Петри со средой и слегка приоткрывают крышку, держа ее большим и указательным пальцами.

3. Петлю с посевным материалом вводят под крышку чашки Петри и снимают избыток посевного материала одним из 2 способов:

а) материал втирают петлей в поверхность среды у края чашки, несколько раз проводя петлей из стороны в сторону (делают небольшую площадку);

б) прокалывают агар петлей у края чашки.

4. Затем засевают материал на этот же сектор, делая параллельные штрихи с интервалом в 4-5 мм от края сектора (чашки) к центру чашки по поверхности среды, поочередно на всех секторах.

Внимание!

1. Необходимо следить, чтобы штрихи не заходили на соседний сектор!

2. Петлю необходимо держать плашмя, чтобы не прокалывать агар в толщину!

14. Провести посевы чистой культуры с целью изучения ее биохимических свойств.

15. Поставить пробу для определения чувствительности выделенной культуры к антибиотикам методом диффузии в агар с применением бумажных дисков. Произвести учет результатов по поставленной пробе и сделать заключение.

Алгоритм определения антибиотикограммы методом диск-диффузии

1. Инокулят в объеме 1-2 мл сразу после изготовления наносят на поверхность подсушенной агаровой среды и равномерно распределяют путем покачивания чашки по всей поверхности и той же пипеткой отсасывают избыток жидкости, (посев «газоном»).

2. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10-15 минут.

3. Затем на поверхность засеянного агара пинцетом накладывают бумажные диски, пропитанные растворами различных антибиотиков, на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 2 см от края чашки. Каждый диск слегка прижимают пинцетом, чтобы он плотно прилегал к поверхности агара.

ВНИМАНИЕ!Одну чашку можно использовать для изучения чувствительности одного штамма к 5-6 антибиотикам! Следите, чтобы на агар не были положены два сцепленных между собой диска! Не забывайте фламбировать пинцет!

4. Чашки с нанесенными на них дисками помещают в термостат при 35 - 37^оС на

18-20 часов в перевернутом кверху дном положении.

При определении чувствительности к метициллину и оксациллину чашки инкубируют при 35 ^оС.

5. Результаты пробы учитывают путем измерения диаметра зон задержки роста микробов вокруг дисков. Чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет настольной лампы падал на них под углом 45^о (учет в отраженном свете). Допускается учет результатов в проходящем свете, однако в этом случае отмечается большая субъективность в оценке диаметров зон задержки роста. С помощью линейки или измерителя (кронциркуль, штанген-циркуль) измеряют диаметры зон задержки роста вокруг дисков, включая диаметр самих дисков, с точностью до 1 мм.

Примечание. Не следует обращать внимание на очень мелкие колонии, выявляемые при определенных условиях освещения в пределах зоны торможения роста. При нерезко очерченных краях зон или зонах с двойными контурами следует измерять диаметр зоны по наиболее четкому контуру, игнорируя мелкие колонии или едва заметный газон у края зоны. При наличии больших колоний по периферии зоны, граница ее определяется местоположением внутреннего края этой группы колоний. Если крупные колонии распределены по всей зоне, культуру следует проверить на однородность, а испытание повторить.

6. Оценку результатов проводят по таблице «Интерпретация значений диаметров зон задержки роста при определении чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (Среда АГВ)» или по таблице № 2 МУ 1983 г.

Полученные значения диаметров зон задержки роста сравнивают с пограничными значениями в таблице и относят изучаемые штаммы к одной из трех категорий чувствительности: устойчивые, умеренно-устойчивые (промежуточные), чувствительные.

Примечание. Для контроля воспроизводимости и точности процедуры определения чувствительности рекомендкется при каждой постановке теста параллельно с испытуемыми штаммами использовать эталонные штаммыE. coli (АТСС 25922),Staphylococcusaureus (АТСС 25923) и Pseudomonasaeruginosa

( АТСС 27853), которые можно получить в ГИСК им. Л. А. Тарасевича.

18. Поставить реакцию Видаля, учесть результат по демонстрационной реакции и сделать заключение.

Разведение сыворотки Ингредиенты	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	КС	КА
ИХН, в мл	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	-	0,5
Сыворотка обследуемого 1:50, в мл	0,5 → 0,5 → 0,5 → 0,5 → 0,5 0,5 - ↓ (1:50) 0,5 в дез. р-р
ОН-диагностикум из сальмонелл брюшного тифа, в каплях	2	2	2	2	2	-	2
Штатив с пробирками энергично встряхивают и помещают в термостат при 370С на 4 часа, а затем оставляют при комнатной температуре до следующего дня
Результат

Примечание:

1.Делают 4 ряда разведений сыворотки обследуемого.

2. В каждый ряд вносят соответствующий диагностикум:

во II-й ряд - ОН-диагностикум из сальмонелл паратифа А;

в III-й ряд - ОН-диагностикум из сальмонелл паратифа В;

в IV-й ряд - 0-9-диагностикум из сальмонелл брюшного тифа.

I) Учет реакции проводят с помощью агглютиноскопа, осторожно встряхивая или медленно наклоняя пробирку.

При «РА-» - взвесь сохраняет исходную мутность, так же как в контроле диагностикума.

При избытке Аг он может осесть на дно в виде плотного комка.

При «РА+» - осадок равномерным слоем покрывает дно пробирки. Края его обычно неровные (так называемый «зонтик»). Надосадочная жидкость просветляется. После легкого встряхивания пробирки в прозрачной надосадочной жидкости всплывают отдельные хлопья агглютината.

17. Поставить реакцию преципитации в геле, учесть ее результат по демонстрационной чашке и сделать заключение.