Специальные методы гистологических исследований.

В качестве объекта исследования могут быть использованы не только срезы, но и мазки, отпечатки, тотальные препараты, культура ткани. Жидкие по консистенции ткани или сами по себе тонкие объекты не требуют изготовления срезов. Например, чтобы получить гистологический препарат крови, достаточно взять ее каплю из пальца здорового или больного человека, сделать тонкий мазок на предметном стекле, зафиксировать его, покрасить и заключить. Маленькие пленочки подкожной соединительной ткани или брыжейки используются целиком (тотальные препараты); при изготовлении тотальных препаратов можно ограничиться фиксацией, окрашиванием и заключением, т.е. не требуется уплотнения и изготовления срезов.

Некоторые ткани (костная, эмаль зуба) обладают значительной прочностью, что затрудняет взятие кусочков и приготовление из них срезов. Для того чтобы получить срез костной ткани необходимо удалить имеющиеся в ее межклеточном веществе известковые соли, т.е. декальцинировать. Перед декальцинацией кость обрабатывают фиксирующим раствором, затем декальцинируют в кислотах (трехуксусной, пикриновой, азотной, серной или соляной) до размягчения. В последующем кость промывают, вырезают кусочек, обезвоживают его, заливают в уплотняющие среды, изготовляют срезы, окрашивают, просветляют, заключают и микроскопируют.

В технике приготовления гистологических препаратов для электронной микроскопии имеются свои особенности; при фиксации используют жидкости, не растворяющие липиды и белки (четырехокись осмия, глутаральдегид, марганцевокислый калий). Производится быстрое обезвоживание в спиртах возрастающей крепости. Для заливки используют эпоксидные смолы (эпон, аралдит). Срезы изготовляются на ультрамикротоме, позволяющем получить сверхтонкие срезы (500 ангстрем). Придание электроннооптической активности структурам достигается контрастированием в 2% ураниацетате или 2% уксуснокислом свинце, основанном на избирательном связывании молекулами ткани соединений тяжелых металлов, интенсивно поглощающих электроны. Затем срезы помещают на металлическую сеточку и рассматривается в потоке электронов.

Исследователя, занимающегося вопросами морфологических основ физиологических явлений, уже не могут полностью удовлетворить методы, позволяющие видеть лишь физические формы конструкции функционирующей ткани безотносительно к химическому составу элементов тканевых структур и протекающих в них биологических процессов. В связи с этим, при изучении гистофизиологии клеток, тканей и органов широко используются гистохимические методы исследования. Гистохимические методы позволяют изучать не только химиоархитектонику тканей, но и изменение локализации биохимических процессов при выполнении ими физиологических функции или при патологических явлениях.

В последнее время усиленно развивается электронная гистохимия, позволяющая установить локализацию различных веществ в клетке, и связать с тем или иным органоидом клетки, процессы синтеза веществ в клетке. Для изучения распределения и выведения из клетки продуктов обмена используется метод авторадиографии. Метод основан на введении в организм веществ, содержащих радиоактивные (меченные) P, C, H, S и др. элементы, включающиеся в обменные процессы клеток. Локализация введенного вещества определяется на гистологическом препарате по излучению, которое улавливается чувствительной эмульсией, нанесенной на препарат. Фотография следов (треков) излучения позволяет судить о распределении введенного радиоактивного элемента в тканях, клетках. С помощью метода авторадиографии определяют в клинике скорость всасывания меченых аминокислот, обмен йода в клетках щитовидной железы и т.д.

Из методов, применимых обычно к фиксированным клеткам и тканям или их компонентов, следует отметить еще гисторентгенографию и рентгеноструктурный анализ.

Гисторентгенография основана на исследованиях поглощения рентгеновских лучей структурами и микрообъектами и позволяет получить количественные данные о содержании, например, кальция в различных участках кости.

Рентгеноструктурный анализ (метод дифракции рентгеновских лучей) нашел широкое применение в исследовании органических кристаллов. В частности, с помощью этого метода изучена молекулярная структура коллагена, гемоглобина, ДНК, миоглобина и т.д.

Количественную оценку изучаемых структур дают биометрические методы исследования. Эти методы позволяют производить подсчет количества клеток (например, подсчет делящихся клеток с последующим определением митотического индекса), измерение диаметра ядра и цитоплазмы клеток, толщину слоев в оболочках сосудов, количественное содержание изучаемых в клетках или тканях веществ и т.д. Для этих целей используют специальные аппараты – окулярмикрометры, цитофотометры и т.д. Количественную оценку качества изучаемых структур можно получить и при использовании интерференционной микроскопии и гисторентгенографии.