Правила работы со световым микроскопом.

1. Перед началом работы микроскоп нужно установить на рабочем месте так, чтобы он был обращен колонкой штатива к наблюдателю, а зеркалом к источнику света; при этом микроскоп должен быть несколько сдвинут влево от наблюдателя, справа необходимо расположить тетрадь (альбом) для зарисовок.

2. Для освещения поля зрения в микроскопе нужно поставить объектив малого увеличения над отверстием предметного столика на расстоянии 1см.

3. Максимально открыть диафрагму, обратить вогнутое зеркало к источнику света, пока поле зрения не станет равномерно и ярко освещено.

4. Перед помещением препарата на столик микроскопа нужно осмотреть его невооруженным глазом, чтобы получить представление о величине и местоположении изучаемого объекта под покровным стеклом. Рассматриваемый объект должен находиться непосредственно под фронтальной линзой объектива.

5. Микрокопирование надо начинать с малого увеличения, что позволяет изучать общую конструкцию той или иной ткани или органа. Большое увеличение служит для более детального изучения определенного участка препарата. Чтобы этот участок попал в поле зрения при большом увеличении, необходимо его поместить в центр поля зрения, пользуясь малым увеличением.

6. С помощью макрометрического винта поднимают тубус микроскопа и поворотом револьвера меняют объектив большого увеличения. Затем наблюдая сбоку, вращают макровинт от себя, пока фронтальная линза объектива не приблизиться почти в плотную к покровному стеклу. Далее, глядя в окуляр, медленно вращают макровинт до появления хотя бы самого нечеткого изображения объекта.

7. Наводка на фокус при большом увеличении обеспечивается микрометрическим винтом.

Специальные виды микроскопии.

Со времени изобретения микроскопа его конструкция подвергалась существенным изменениям. Появились микроскопы специального назначения.

Ультрафиолетовая микроскопия основана на абсорбции ультрафиолетовых лучей химическими компонентами клеток (белки, нуклеиновые кислоты и др.). Ультрафиолетовые лучи имеют более короткую длину волны, что обеспечивает более высокую разрешающую силу микроскопа. В ультрафиолетовых микроскопах (пример: МУФ – 3) в качестве источника света используется ртутная лампа, излучающая ультрафиолетовые лучи в диапазоне волн от 250 до 400мк. Такие микроскопы имеют особую кварцевую оптику, хорошо пропускающую ультрафиолетовые лучи.

Ультрафиолетовая микроскопия применяется для прижизненных наблюдений в гистохимии.

Фазово-контрастная микроскопия.

Хотя все компоненты клетки прозрачны для видимого света, тем не менее они обладают некоторой способностью изменять фазу проходящих через них лучей, ибо разные участки клеток отличаются показателем преломления и толщиной. С помощью фазово-контрастного микроскопа эту разность фаз можно усилить и сделать видимой для глаза.

Как же это достигается? Для этого отклоненную в результате дифракции волну дополнительно сдвигают в ту или иную сторону на ¼ ее длины с помощью кольцевой пластинки, помещенной в задней фокальной плоскости объектива. Фазовый эффект создается в результате интерференции центральных лучей, не отклонившихся при прохождении через объект, и боковых, диафрагированных. В фазово-контрастном микроскопе небольшая разница фаз прямого и диафрагмированного лучей превращается в разность амплитуд, что позволяет наблюдать частицу визуально или фотографировать. Таким образом благодаря фазово-контрастному микроскопу, различия по фазе превращаются в различия по яркости.

Фазово-контрастная микроскопия находит широкое применение при исследовании живых клеток, т.к. дает возможность рассматривать их тонкие детали. Особую ценность фазово-контрастная микроскопия представляет для исследования клеток, культивируемых in vitro (в пробирке). При дополнительном применении ускоренной или замедленной микросъемки можно изучить процессы в динамике (например, периоды деления).

Интерференционная микроскопия основана на тех же принципах, что и фазово-контрастная микроскопия, но в отличие от последней, дает возможность получить количественные данные о сухой массе, показателе преломления объектов и их толщине. Принцип устройства интерференционного микроскопа состоит в том, что свет от источника расщепляется на два пучка, один из которых проходит через объект, другой – минует его. Таким путем добиваются сдвига фаз. В последующем оба пучка соединяются и интерферируют друг с другом как в фазово-контрастном микроскопе.

Микроскопия в темном поле зрения используется для исследования живой клетки. Этот метод основан на появлении рассеяния света на границе двух сред с разными показателями преломления. Конденсор темнопольного микроскопа приспособлен для бокового освещения объектов; так как в этом случае прямой свет не попадает на объектив, то объект, освещенный рассеянным светом, кажется светлым, тогда как фон остается темным.

Поляризационная микроскопия основана на анизотропии (двойном лучепреломлении) некоторых компонентов клеток и тканей. В изотропных структурах поляризованный свет распространяется с одинаковой скоростью в любом направлении, так как показатель преломления этих структур имеет постоянное значение и не зависит от направления распространения света. В анизотропных же структурах скорость распространения поляризованного света зависит от ориентации плоскостей поляризации и направления падающего пучка. Эта зависимость связана с тем, что в анизотропных структурах показатель преломления может иметь два значения, соответствующие различным скоростям распространения света (поэтому эти структуры называют двоякопреломляющими). Разность этих показателей составляет величину двойного лучепреломления. Таким образом, при помощи поляризованного микроскопа измеряется разность хода лучей (сдвиг фазы), поляризованных в перпендикулярных друг другу плоскостях. Сдвиг фаз зависит от величины двойного лучепреломления и толщины объекта.

Измерение производят при помощи компенсатора, вводимого в оптическую систему микроскопа; результат измерения выражают в миллимикронах.

В отличие от обычного микроскопа в поляризационном микроскопе имеются поляризованные устройства (поляризатор и анализатор), которые поляризуют свет в двух взаимно перпендикулярных плоскостях. Поляризатор помещается под конденсором и превращает свет, падающий на объект, в плоскополяризованный. Анализатор расположен под линзой объектива. При вращении анализатора на 360⁰ поле зрения становится то светлым, то темным через каждые 180⁰. При взаимно перпендикулярном расположении поляризатора и анализатора поляризованный свет не пропускается, и поле зрения микроскопа становится темным. Если в этих условиях поместить на предметный столик микроскопа анизотропный объект, свет, проходящий через него, оказывается частично поляризованным, и поле зрения просветляется. Поляризационный микроскоп позволяет выявить структуры с упорядоченным расположением молекул (поперечнополосатая мышечная ткань, фибриллярные структуры).

Конфокальная микроскопия

Глубина фокуса обычного светового микроскопа сравнительно велика, особенно при использовании объективов малого увеличения. Это означает, что одновременно в фокусе можно видеть препарат на довольно существенную глубину, что вызывает наложение изображений трехмерного объекта.С другой стороны, при конфокальной микроскопии в фокусе одновременно видна только очень тонкая плоскость препарата. Это явление основано на двух принципах:(1) объект освещается очень небольшим пучком света (тогда как в обычном световом микроскопе образец освещен очень крупным пучком лучей, буквально «утоплен» в нем и (2) полученное изображение образца должно пройти через мелкое отверстие. В результате такое изображение, возникающее в плоскости фокусировки, достигает детектора, тогда как изображения кпереди и кзади от этой плоскости блокируются (рис. 1-5). При этом картины несфокусированных объектов, снижающие качество изображения, теряются, а обнаружение объектов в плоскости фокусировки значительно улучшается, что позволяет локализовать любой компонент препарата со значительно большей точностью, чем при использовании обычного светового микроскопа.

В практических целях в большинстве конфокальных микроскопов используется следующая схема (рис. 1-6): 1) освещение обеспечивается лазерным источником; 2) посколько он дает очень маленькую точку, она должна перемещаться по всему образцу (сканирование), чтобы обеспечить наблюдение значительной его части; 3) изучаемый компонент образца должен быть маркирован флюоресцентной молекулой (что означает невозможность изучения обычных срезов); 4) для создания изображения используют свет, который отражается от образца; 5) поскольку отраженный свет захватывается детектором, сигнал можно усилить электронным путем, чтобы его можно было видеть на мониторе.

Так как лишь очень тонкая плоскость фокусировки (называемая также оптическим срезом) выявляется в каждый момент времени, можно объединить несколько плоскостей фокусировки одного образца и реконструировать их, превратив в трехмерное изображение. Для создания такой реконструкции и реализации многих других параметров конфокальный микроскоп нуждается в мощном компьютерном обеспечении.

Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия

Под влиянием ультрафиолетовых, рентгеновских и γ-лучей некоторые объекты становятся способными светиться. Ряд структур и веществ, содержащихся в некоторых клетках, обладают собственной (первичной) флуоресценцией (хрящ, роговой слой эпидермиса кожи, коллагеновые и эластические волокна, липоиды, порфирин, витамин А и В₂₎. При обработке люминесцентными красителями (хлорохромами) отдельные компоненты клетки (под влиянием поглощенной ими световой энергии) приобретают способность светиться (вторичная флюоресценция). Некоторые флюорохромы избирательно окрашивают клеточные структуры и вещества. Так, акредин оранжевый избирательно «красит» ДНК в зеленый цвет, а РНК – в оранжевый. Это свойство акридина оранжевого используется при изучении локализации нуклеиновых кислот в клетках различных тканей и органов животных.

В отличие от светового микроскопа, в люминесцентном микроскопе объект становится видимым не благодаря свету от первичного источника, а из – за люминесценции (свечения) в самом препарате.

В качестве источника ультрафиолетовых лучей в люминесцентном микроскопе используется ртутная лампа. Лучи испускаемые ею, проходят через кварцевый коллектор и систему фильтров. Кварцевый коллектор служит для фуксировки лучей, которые имеются в излучении лампы. Наиболее важным является ультрафиолетовый фильтр – черное стекло, почти непрозрачное для видимого света благодаря содержанию окиси никеля. Однако, этот фильтр пропускает только некоторое количество красного света. Чтобы устранить этот свет, применяют дополнительный фильтр 2-2,5% водный раствор сернокислой меди, налитой в кюветку. Над окуляром микроскопа располагается светло – желтый фильтр, поглощающий ультрафиолетовые лучи и защищающий от них глаз наблюдателя. Люминесцентная микроскопия широко используется при изучении живых объектов, в гистохимии и иммуноморфологии.

В ряде гистологических исследований применяют макро–микроскопические методы, предназначенные для изучения структур, находящихся на границе макроскопических и микроскопических величин.

Важными вспомогательными приборами при микроскопии являются нагревательный столик, измерительный окуляр, окуляр-микрометр, объект-микрометр, рисовальный аппарат, фото-насадка.

Среди новых типов микроскопов особое место занимает телевизионный, позволяющий рассматривать изображение препарата непосредственно на экране кинескопа, что дает ряд преимуществ по сравнению с непосредственным рассматриванием объектов через окуляр.

Все виды световой микроскопии лимитированы в своем применении длинной волны видимого или невидимого (ультрафиолетового) света.

Это препятствие преодолено у новых «сверхмикроскопов», использующих в качестве пучка света поток электронов или других частиц для «освещения» объекта.

Электронная микроскопия. Ход лучей в электронном микроскопе в принципе одинаков с таковым в световом микроскопе. Однако роль пучка света играет в нем поток электронов, а роль линз – магнитное поле. В электронном микроскопе пучок электронов испускается металлической частью (катодом). При помощи магнитной катушки, играющей роль конденсора, пучок электронов фокусируется в плоскости объекта, затем отклоняется другой магнитной катушкой, которая действует как линза объектива и дает увеличенное изображение объекта. Третья магнитная «линза», действующая в качестве окуляра, увеличивает изображение объекта, полученное в объективе. Окончательное изображение можно видеть на экране или фиксировать на фотографической пленке.

Если в световом микроскопе формирование изображения зависит, главным образом, от степени поглощения света в различных участках объекта, то в электронном микроскопе оно обусловлено рассеянием электронов. Последнее зависит от толщины объекта, плотности упаковки в нем молекул и особенно от атомного номера входящих в молекулы элементов. Чем выше атомный номер элемента, тем большее рассеивание он вызывает. Большинство атомов, входящих в состав биологических структур, имеет низкий атомный номер и играет незначительную роль в формировании изображения. Поэтому к биологическим молекулярным структурам приходится добавлять тяжелые атомы (с помощью различных методов фиксации и напыления).

Большим достоинством электронного микроскопа является высокая разрешающая сила. Теоретически рассчитано, что разрешающая сила электронного микроскопа может быть около 0,02 А (0,000002 мк), т.е. в 100 тыс. раз выше, чем в световом микроскопе. Практически разрешающая сила современных электронных микроскопов лучших марок составляет 1-7 А (1А=0,0001мк), что позволяет изучить клетку на молекулярном уровне.

В последние годы созданы новые марки электронных микроскопов, в которых вместо плоскостного изображения объекта получены трехмерные изображения (сканирующий электронный микроскоп).

Принцип работы сканирующего электронного микроскопа заключается в том, что регистрируются только вторичные электроны, «выбитые» из атомов изучаемого объекта первичными электронами, которые испускаются, как и в обычном электронном микроскопе, катодом. Выбитые электроны действуют как игольчатые зонды, позволяя выявить на электронных микрофотографиях все выступы и впадины на поверхности объекта (например, клетки).