63. Метод абсолютной калибровки и внутреннего стандарта

Метод абсолютной калибровки основан на том, что для, количественного определения содержания компонентов в анализируемой пробе, необходимо для каждого определяемого в пробе индивидуального вещества построить калибровочную кривую зависимости площади или высоты хроматографического пика от содержания этого вещества в анализируемой пробе. Необходимость такой трудоемкой работы обусловлена тем, что чувствительность детектора хроматографа к различным веществам даже близкой химической структуры, как правило, неодинакова.

Построение калибровочных кривых производят по результатам хроматографирования в одинаковых условиях известных количеств определяемого вещества. Зависимость площади S_i или высоты хроматографического пика от содержания q_i вещества в анализируемой пробе при достаточно строгом воспроизведении условий хроматографирования является линейной и угловой коэффициент (тангенс угла наклона) калибровочной прямой i-го компонента называется калибровочным коэффициентом K_i,г/см²:

(1.59)

Процентное содержание i-го компонента X_i в пробе составит

(1.60)

где Q масса анализируемой пробы, г.

Метод абсолютной калибровки достаточно прост, но точность его в значительной мере зависит от постоянства режима и тщательности приготовления и анализа эталонов или их смесей.

Недостаток метода состоит в том, что приходится строить калибровочные графики для каждого индивидуального вещества, на что тратится много времени и расходуются эталонные вещества. Поэтому его применяют, главным образом, при определении одного или нескольких компонентов смеси, например, микропримесей.

Метод внутреннего стандарта (метод метки) основан на сравнении высот или площадей пиков известного вещества-метки и определяемых компонентов. В качестве внутреннего стандарта (метки) стараются подобрать такое вещество, которое бы не реагировало с компонентами смеси, не очень сильно сорбировалось и появлялось на хроматограмме отдельно от других компонентов. Кроме того, его не должно быть в составе исследуемой смеси.

К анализируемой пробе добавляют точно известное количество вещества-метки. Количество метки подбирают такое, чтобы площадь его пика была соизмерима с площадью пиков компонентов смеси, подлежащей количественному определению. Для калибровки следует провести хроматографический анализ ряда смесей вещества-метки с каждым из отдельных определяемых компонентов при различных соотношениях обоих веществ в смеси. По оси абсцисс откладывают значения отношения массы метки q_m к массе анализируемого вещества q_i (q_m/q_i) в искусственных смесях, а по оси ординат  соответствующее им соотношение площадей пиков S_m/S_i.

В узкой области соотношений q_m/q_i график прямолинеен. Угловой коэффициент такого графика К_iпредставляет собой калибровочную константу для данного определяемого компонента. Он вычисляется из уравнения

. (1.61)

Отсюда .

Калибровочная константа практически не зависит от количества добавляемой в колонку искусственной смеси и мало изменяется при изменении скорости потока подвижной фазы и температуры колонки. Относительное содержание вещества-метки I_m в смеси рассчитывается по следующей формуле:

. (1.62)

Относительное содержание определяемого компонента I_i

, (1.63)

где  масса вещества-метки в пробе;  масса определяемого вещества в пробе;Q весовое количество пробы смеси, введенное в колонку.

Разделив I_m на I_i получаем

,. (1.64)

откуда .

Процентное содержание определяемого вещества вычисляется из уравнения

, (1.65)

а так как , то _. (1.66)

Таким образом, чтобы провести анализ и количественный расчет методом метки, нужно:

1) составить ряд искусственных смесей определяемого вещества с веществом-меткой, снять ряд хроматограмм при режиме анализа смеси и измерить соотношение площадей соответствующих пиков; на основании полученных данных построить графики в координатах ; рассчитать калибровочную константу K_i;

2) определить приблизительное весовое количество анализируемой смеси, которое нужно вводить в колонку, чтобы получить достаточно хорошо выраженный пик определяемого компонента; подобрать такое количество вещества-метки, при котором на хроматограмме появился бы пик метки, соизмеримый с пиком определяемого компонента; приготовить стандартную смесь метки и компонентов; вычислить I_m по следующей формуле:

. (1.67)

3) в хроматографическую колонку ввести пробу анализируемой смеси с известным содержанием метки и снять хроматограмму; измерить площадь пика определяемого компонента S_i и пика вещества метки S_m; зная калибровочную константу K_i, рассчитать процентное содержание компонентов по формуле

(1.68)

Если необходимо определить несколько компонентов, то для каждого из них находят калибровочную константу описанным способом.

Метод метки удобен тем, что на результаты анализа колебания параметров хроматографического опыта сказываются слабо. Но если дозировка объемов анализируемых образцов проводится достаточно точно, этот метод никаких преимуществ перед методом абсолютной калибровки не имеет. Кроме того, использование метода метки ограничивается преимущественно определением лишь небольшого числа компонентов, содержание которых в не очень сложных по составу смесях не превышает примерно 10%.