2. Описание методик выполнения практических заданий

2. 1. Эпизоотология и инфекционные болезни животных

Задание №1. Провести крове-капельную реакцию агглютинации (ККРА) для исследования на пуллороз

Цель: показать навыки проведения серологического исследования и умение правильно интерпретировать результаты исследований.

Материалы и оборудование: птица, антиген пуллорозный цветной, дезинфицирующий раствор, стерильные скарификаторы, ножницы, бактериологическая петля, предметные стекла, тампоны, грелка-качалка, спиртовка.

Для прижизненной диагностики пуллороза у взрослых птиц и ремонтного молодняка (у цыплят – с 50-55-дневного возраста) применяют серологическое исследование крови методом кровекапельной реакции непрямой гемагглютинации (ККРНГА) с эритроцитарным диагностикумом или кровека­пельной реакции агглютинации (ККРА) с цветным диагностику­мом на предметном стекле. Чтобы устранить неспецифическую ре­акцию, за 10 дней до серологических исследований прекращают да­вать лекарственные препараты и за 2...4 дня исключают из рациона рыбий и технические жиры, а также мясную и мясокостную муку.

Эритроцитарный антиген для ККРНГА пред­ставляет собой коричневого цвета жидкость, состоящую из 10%-й взвеси формализованных эритроцитов барана, сенсибилизирован­ных полисахаридно-полипептидной фракцией возбудителя пулло­роза.

Цветной пуллорозный антиген для ККРА - густая синего цвета жидкость, состоящая из взвеси бактерий в концен­трации 10 млрд/мл, которые при хранении выпа­дают в осадок.

Птицу фиксируют, охватывая обеими руками туловище, прижимая к туловищу крылья и пропуская между пальцами конечности. Каплю, крови берут из гребня (путем уко­ла или надреза) или из подкрыльцовой вены и переносят петлей из платиновой или другой неокисляемой проволоки (толщиной в 0,5—0,6 мм и внутренним диаметром 2,5—3,0 мм) на чистое обезжиренное предметное стекло. Стекло ставят на грелку-качалку (при температуре 37...40°С) и вносят в каплю, крови две капли 1:2 цветного антигена. Смешивают этой же петлёй.

Каждую пробу крови от птиц надо брать отдельной петлёй, которую каждый раз после использования следует обсушивать марлей и прокаливать на спиртовке. Так же надо обрабатывать и инструменты для взятия крови.

Учёт результатов реакции.

При постановке ККРА реакцию учитывают в течение 30 секунд и не позднее 1 мин. При неспе­цифических показателях реакции наступают позднее и учету не подлежат.

При положительной реакции образуются хорошо видимые фиолетовые хлопья на фоне просветления – агглютинация микроорганизмов.

Задание №2. Взять от животного носовой секрет и приготовить его для отправки в ветеринарную лабораторию для вирусологического исследования

Цель: показать навыки отбора и отправки в лабораторию патологического материала.

Материалы и оборудование: спецодежда, стериль­ный физиологический раствор, термос со льдом, стерильные пробирки, пенициллиновые флаконы с пробками, спиртовка, графитный карандаш, лейкопластырь, стерильные тампоны, пинцеты, дезинфицирующий раствор, мыло, полотенце.

В целях сохранения вируса патологический материал для вирусологического исследования отбирают от животных в острой форме течения болезни, либо убитых в агональный период. Пробы важно взять как можно быстрее (не позднее 2-3 часов после убоя) и по возможности в стерильных условиях. Используют отдельную стерильную посуду для каждой пробы и стерильные инструменты.

Наружные покровы, кожу передней части носовых ходов, глаз, вокруг клоаки обмывают водой и протирают дезинфицирующим раствором (возможно 70% спирт).

Смывы со слизистой оболочки носа, с конъюнктивы, прямой кишки и клоаки берут стерильными тампонами и помещают в стерильные пробирки или пенициллиновые флаконы, содержащие по 3-5 мл стерильного физиологического раствора или специального раствора для предотвращения быстрой инактивации вирусов (раствор Хенкса или среды для культур клеток (ГЛА, 199, Игла) с антибиотиками (пеницил­лин и стрептомицин по 500 ЕД и нистатин по 20 ЕД на 1 мл сре­ды). Флаконы закрывают резиновыми пробками.

Пробы материала для вирусологического исследования необходимо как можно быстрее поместить в условия, обеспечивающие замедление процессов инактивации вирусов. Такие условия обеспечивают низкие температуры. Наилучший и простой метод сохранения биологических свойств вирусов в патологическом материале — охлаждение. Пробирки со смывами заворачивают в вату или упаковочную бумагу и плотно укладывают в термос, заполненный на 1/3 снегом или льдом. При этом в термосе в течение 12...24ч удерживается температура 2...6ºС, при которой вирусы сохраняются практически без изме­нений.

Вместо замораживания можно использовать для консервирования химические средства: 30...50% -й глицерин на стерильном физиологическом раство­ре. Этот метод менее эффективный и малопригодный для вируссодержащих жидкостей, обычно его используют для консервирования кусочков паренхиматозных органов и тканей. Употребление глицерина делает невозможным исследование патологического материала методом иммунофлюоресценции. Поэтому одновременно с пробой патматериала необходимо направлять мазки-отпечатки, приготовленные и фиксированные на предметном стекле, для исследования в люминесцентном микроскопе.

Патологический материал снабжают чёткой этикеткой на пробирке, флаконе. Можно использовать лейкопластырь и запись вести простым карандашом. Указывают, какой материал, и от какого животного получен. На термос навешивают этикетку, в которой указывают хозяйство, вид животного, вид материала, количество проб, дату. Термос опечатывают и отправляют с сопроводительным документом.

Сопроводительный документ содержит полную информацию о животном, от которого взяты пробы, эпизоотологические данные хозяйства, предположительный диагноз и данные о вакцинации, лечении, а также дату и фамилию врача. Этими данными руководствуются при выборе направления лабораторных исследований.

Доставленные в лабораторию пробы рекомендуется немедленно использовать для выделения вируса. Если исследование откладывается, его хранят при температуре минус 40 -70 градусов.

Задание № 3. Написать сопроводительный документ на патологический материал, направляемый в ветеринарную лабораторию для бактериологического исследования на сальмонеллез, на пробы сыворотки крови для серологического исследования

Цель: показать навыки грамотного оформления сопроводительных документов на патологический материал.

Материалы и оборудование: образец сопроводительного документа, пишущая ручка, бумага.

Перед отправкой в лабораторию на патологический материал составляется сопрово­дительный документ (форма 3) в 2 экземплярах (один экземпляр с отметкой лаборатории оставляют у себя), в котором указывается:

- название и адрес хозяйства;

- фамилия ветеринарного работника, направляющего материал;

- вид исследования;

- вид, возраст и принадлежность животного, от которого получен материал;

- характер и количество материала, и число упаковок с пробами;

- на какую инфекцию необходимо исследовать;

- как законсервирован материал;

- при необходимости – данные патологоанатомического вскрытия;

- описание клинико-эпизоотологических данных (включая данные о вакцинации)

Форма 3

В______________________________________________________ ветеринарную лабораторию

Адрес___________________________________________________________________________

При этом направляется для ________________________________________________________

патологический материал (перечислить какой) _______________________________________

от _______________________________, принадлежащего___________________________

(вид и возраст животного) (название хозяйства, фермы)

Дата заболевания животного_______________________________________________________

Дата падежа_____________________________________________________________________

Клиническая картина_____________________________________________________________

Данные патологоанатомического вскрытия __________________________________________

Предположительный диагноз______________________________________________________

Дата отправления материала_______________________________________________________

Должность.________________________________ Подпись._____________________________

Образец 1

Отметка лаборатории ___________________________

Дата и время поступления материала _________________

Доставка ____________________________________

Забраковано____________________________

Материал принял__________________________

СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ

Адрес: Республика Хакасия г. Абакан ул. Щорса 5

ГУ РХ «Хакасская ветеринарная лаборатория»

При этом направляется для бактериологического исследования на сальмонеллез и колибактериоз патологический материал: кишечник с содержимым, печень, желчный пузырь, трубчатая кость от трупа телёнка, возраст 1 месяц, принадлежащего ферма № 1, отделение Кузьминка 000 «Новотроицкое» Бейского района РХ.

Животное заболело 25 июня 2009 г.

Дата падежа 29 июня 2009 г.

Клиническая картина: температура 41,0 С, понос, часто тужится, слабость, угнетение, запрокидывает голову набок, стонет, частое мочеиспускание.

При патологоанатомическом вскрытии обнаружено поражение тонкого отдела кишечника (кровоизлияния, слизистая оболочка набухшая, гиперемирована), лимфоузлы брыжеечные набухшие, гиперемированы, селезёнка увеличена, пульпа размягчена.

Предположительный диагноз: сальмонеллёз, колибактериоз.

Материал консервирован (указать – чем).

Дата отправки материала: 29 июня 2009 г.

Ветеринарный врач отделения

ООО «Новотроицкое» А.Б. Петров

Доставил: ФИО - роспись

Образец 2

Отметка лаборатории ___________________________

Дата и время поступления материала _________________

Доставка ____________________________________

Забраковано____________________________

Материал принял___________________________

СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ

ГУ РХ «Хакасская ветеринарная лаборатория»

Адрес: Республика Хакасия г. Абакан ул. Щорса 5

При этом направляется для планового серологического исследования на лептоспироз десять проб сыворотки крови лошадей, принадлежащих частному сектору с. Калинино Аскизского района Республики Хакасия. Хозяйства благополучны по лептоспирозу, животные не вакцинированы.

Опись животных

№ п/п	Наименование хозяйства, ФИО владельца	Инвентарный номер	Пол, возраст	Результат исследования
				РСК	РА	РМА

Дата отправки материала: 29 июня 2009 г.

Материал консервирован (указать – чем)

Ветеринарный врач ветучастка А. Б. Пантелеев

Доставил: ФИО - роспись

Задание № 4. Отобрать пробы смывов с поверхности стола для бактериологического контроля качества дезинфекции.

Цель: показать навыки отбора проб материала для контроля качества дезинфекции и знание методики бактериологического контроля.

Материалы и оборудование: стерильные ватные тампоны массой 0,25...0,33 г, на деревянных, металлических палочках, вмонтированные в пробирки с ватными пробками, стерильный физиологический раствор или стерильная вода, трафарет 10*10 см (из проволоки).

Качество дезинфекции помещений при болезнях, вызываемой бактериальной и вирусной микрофлорой, контролируют бактериологическим методом, определяя наличие санитарно-показательных микроорганизмов (кишечной палочки и стафилококка)

По наличию кишечной палочки определяют качество профилактической и вынужденной дезинфекции при сальмонеллезах, роже и чуме свиней, бруцеллезе, чуме птиц; текущей дезинфекции - при ящуре. По наличию стафилококков определяют качество заключительной дезинфекции при оспе овец и птиц, лептоспирозе, туберкулезе, вирусном гепатите утят и ящуре.

Для отбора проб используют стерильные увлажнённые ватные тампоны на палочках, вмонтированные в пробирки с ватными пробками. В день взятия смывов в каждую пробирку с тампоном наливают стерильно физиологический раствор либо раствор, нейтрализующий дезинфектант в объеме 5 мл.

Если в качестве дезинфектанта применяли хлорсодержащие средства, для нейтрализации используют раствор тиосульфата натрия, если щелочные - раствор уксусной кислоты, для формальдегидосодержащих препаратов используют нашатырный спирт, при отсутствии специфического нейтрализатора (фенолсодержащие препараты и др.) - стерильную воду.

Пробы смывов отбирают через 2...3 часа после окончания профилактической дезинфекции или по истечении определенной экспозиции при вынужденной дезинфекции с 10...20 различных участков (пола, стен, углов, кормушек, оборудования). Для этого скальпелем, мелом или с помощью трафарета намечают квадраты размером 10*10 см и протирают их в течение 1…2 мин ватным тампоном, хорошо отжатым в колбочке.

Тампон кладут обратно в ту же пробирку, погружая в раствор, и не позднее чем через 2 ч доставляют в лабораторию.

На каждой пробирке отмечают порядковый номер по номеру объекта, с которого взят смыв.

В сопроводительном документе указывают: назначение и адрес хозяйства, вид животных, диагноз, дату заболевания, дату наложения карантина или ограничений, дату и время дезинфекции, дату и время взятия проб, санитарное состояние помещений, качество механической очистки, должность и подпись лица, взявшего пробы для исследования.

Пробы в лаборатории исследуют в день их поступления:

- для идентификации кишечной палочки производят посев смывов на среды с лактозой (Хейфеца, Кесслер, Кода); при этом в пробирку со средой опускают тампон и смывную жидкость. Выдерживают посевы в термостате при 37 С в течение 18-24 ч. и пересевают на среду Эндо. Из колоний на Эндо, характерных для кишечной палочки (малиновые), готовят мазки и окрашивают по Грамму, микроскопируют. Помутнение среды Хейфеца и изменение ее цвета после инкубирования в термостате из малинового в зеленый или салатный при газообразовании свидетельствует о наличии в посевах кишечной палочки. Другие цветовые изменения среды, обусловленные ростом другой микрофлоры, не учитывают;

- для идентификации стафилококков посевы смывов проводят в 5 %-й сахарозный бульон (5 мл) с последующим пересевом через 24 ч инкубации в термостате при 37* С на 8,5 %-й солевой МПА и снова выдерживают 24 ч при той же температуре. Выросшую на питательных средах бактериальную культуру исследуют под микроскопом (для стафилококков характерны скопления грамположительных шаровидных клеток в виде грозди).

Дезинфекцию признают удовлетворительной, если бактериального роста нет при профилактической и заключительной дезинфекции во всех пробах. При текущей дезинфекции допускается бактериальный рост не более, чем в 10% проб.

Задание № 5. Оценить биологические препараты (вакцины, аллергены) на их пригодность к применению.

Цель: показать навыки по оценке пригодности биопрепаратов.

Материалы и оборудование: биологические препараты.

Требования, предъявляемые к биологическим препаратам. Био­препараты выпускают в ампулах и флаконах различного объема. На каждой ампуле или флаконе должны быть наклеены этикетки, содержащие следующую информацию:

- наименование и местонахождение предприятия-изготовителя;

- название препарата;

- количество препарата с указанием активности в единицах;

- состав препарата, если он поливалентный;

- номер серии;

- номер государственного контроля;

- срок годности препарата и дата его изготовления.

В каждую упаковку вкладывают наставление по применению препарата, утвержденное Департаментом ветеринарии МСХ РФ. Все биопрепараты должны быть изготовлены в соответствии с оп­ределенными ГОСТом, ТУ и пройти обязательный государствен­ный контроль.

Во время транспортировки и хранения препарат может испор­титься, поэтому перед применением его обязательно тщательно осматривают.

Препарат непригоден для использования в следующих случаях:

- отсутствует этикетка (надпись на флаконе) или не указан но­мер серии и (или) контроля;

отсутствует наставление по применению;

- нарушена укупорка флакона, целостность флакона (ампулы, пробирки и пр.);

- промерзла жидкость во флаконе (для жидких препаратов);

изменен обычный внешний вид (цвет, консистенция, запах и т. д.);

- в содержимом флакона присутствуют пленки, хлопья, плесень, комочки, сгустки или осадок, не разбивающийся при встряхива­нии;

- истек срок годности препарата.

Правила использования биопрепаратов. Перед использованием упаковки проверяют этикетку и обращают внимание на номера серии и контроля, а также внешний вид препарата. Уточняют пра­вила его использования (по наставлению) и дозировку.

Жидкие препараты, содержащие депонирующие вещества (квасцы, ГОА, масляный адъювант и т. п.), тщательно встряхива­ют до получения равномерной взвеси.

При растворении сухих препаратов применяют только указан­ный в наставлении растворитель (разбавитель). Чаще всего это стерильная дистиллированная вода.

Живые вакцины не содержат консервантов, поэтому при их вскрытии необходимо соблюдать правила антисептики и избегать попадания в препарат дезинфицирующих средств.

Вскрытые флаконы должны быть использованы в этот же день. Неиспользованные, выбракованные препараты утилизируют автоклавированием или кипячением.

По истечении срока годности препараты бракуют или отправля­ют (если осталось много) на повторный контроль во ВГНИИКСС (в этом случае срок годности может быть продлен).

Биопрепараты выбраковывают комиссионно, составляют акт.

Задание № 6. Приготовить для отправки в лабораторию мазки-отпечатки из органов для исследования в МФА (методом флюоресцирующих антител).

Цель: показать навыки приготовления бактериологических препаратов.

Материалы и оборудование: предметные стекла, спирт, спиртовка, простой карандаш, патологический материал (печень), стерильные инструменты (скальпель, ножницы, пинцет)

Для исследования иммунофлуоресцентным методом используют мазки, отпечатки, гистологические срезы и культуры клеток. Патологический материал, консервированный глицерином, не используют для исследования методом иммунофлюоресценции.

Предметные стекла, применяемые для приготовления препа­ратов, должны быть тонкими, чистыми, обезжиренными, бесцвет­ными и не иметь царапин. Для этого их промывают в нейтраль­ных детергентах, прополаскивают в дистиллированной воде и сохраняют в спирте или смеси спирта с эфиром. Перед употреб­лением чистые стекла проводят через пламя горелки и охлажда­ют.

Все надписи делают простым карандашом на специально подготовленной матовой площадке у края предметного стекла. Надписи восковым карандашом при фиксации препаратов растворяются и образуют на стекле восковую пленку, мешающую обработ­ке мазков флуоресцирующими сыворотками.

Из органов готовят отпечатки: стерильно вырезают кусочек органа, поверхностью среза несколько раз касаются поверхности предметного стекла или прикладывая быстрым движением предметное стекло к поверхности органа. Отпечаток должен быть тонким и равномерным.

Мазки-отпечатки подсушивают на воздухе, затем фиксируют химическим или физическим способом. При вирусных инфекциях используют химический способ - на предметное стекло с мазком наносят одну из следующих жидкостей: чистый охлаждённый ацетон 10-20 минут (при особо опасных инфекциях – бешенство, не менее 4 ч ), 96 %-й этанол – 10 мин и сохраняют в холодильнике до исследования (при минус 4 °С, минус 70 °С).

При бактериальных инфекциях мазки-отпечатки можно фиксировать нагреванием на пламени спиртовки – препарат обратной стороной стекла два-три раза медленно проводят над пламенем горелки. Фиксация необходима для закрепления антигена на стекле и для безопасности работы.

Для контроля таким же образом готовят препараты из органов здо­ровых животных.

Подготовленные препараты исследуют методом МФА, окрашивая их люминесцирующими специфическими сыворотками.

Задание № 7. Провести диагностику дерматомикоза у кошки микроскопическим методом.

Цель: показать навыки микроскопического исследования для постановки диагноза на дерматомикозы

Материалы и оборудование: пробы волос от животных, больных трихофитией, препаровальные иглы, пинцеты анатомические, чашки Петри, 10-20% гидроксид натрия или калия, 50 % глицерина, предметные и покровные стекла, микроскопы, резиновые перчатки.

Диагноз на дерматомикозы устанавлива­ют на основании эпизоотологических и клинических данных, а также результатов лабораторных исследований, включая микроскопическое исследование поражённых волос, чешуек, корочек с поражённых участков, граничащих со здоровой кожей.

Для микроскопического исследования патологический мате­риал помещают в чашку Петри и залива­ют 10%-м раствором гидроксида натрия, затем ставят на 15...20 мин в термостат или слегка подогревают, после чего рас­щепляют препаровальными иглами. Необходимое количество материала переносят на предметное стекло в каплю 50%-го ра­створа глицерина, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом – сначала под малым увеличением, затем с объективом на 40 или под иммерсией.

Грибы рода Trichophyton при микроскопическом исследовании обнаруживают в виде прямых гифов мицелия с перегородками, лежащими параллельными рядами по длине волоса. Споры одно­клеточные, круглые, овальные, расположены муфтами или цепоч­ками у основания волоса.

Грибы рода Microsporum под микроскопом представляют собой округлые одноклеточные, резко преломляющие свет споры, расположенные, как правило, беспорядочно внутри волоса и на его поверхности.