3.6.2. Огляд та підготовлення обладнання перед використанням

Під підготовкою обладнання має на увазі очищення, миття та дезінфекційну обробку внутрішніх і зовнішніх його поверхонь.

Підготовку обладнання проводять перед початком або після закінчення технологічної операції, або в кінці зміни. Її слід проводити у спеціальному одязі, призначеної для роботи у виробничих приміщеннях відповідного класу чистоти і, при необхідності, в респіраторі.

Для обробки обладнання рекомендується використовувати поролонові губки або серветки з тканини без ворсу із закладеними краями. При необхідності слід застосовувати щітки або лопатки з синтетичних матеріалів, а також застосовувати пилосос. Після використання матеріали перуть, а інвентар миють у розчині теплої води з миючим засобом, потім прополіскують у чистій водопровідній воді, висушують у спеціально призначеному для цього місці. Перед використанням матеріали та інвентар знезаражують у розчині дезінфікуючого засобу.

Перед початком підготовки відключають від електричного струму обладнання та електроприлади. Видаляють за допомогою щіток, лопаток, пилососа або вологої серветки механічне забруднення або пил з зовнішніх і внутрішніх поверхонь обладнання. Рідини витирають, а при необхідності використовують засоби для знежирення. Обладнання миють спочатку теплою водою (45 ±5)ºС з миючим засобом, потім промивають водою очищеною і висушують або витирають насухо.

Проводять дезінфекційну обробку, протираючи поверхні дезинфікуючим розчином або витримуючи в ньому. Після дезінфікуючої обробки обладнання промивають гарячою водою очищеною.

Після закінчення підготовки обладнання оформлюють відповідний протокол, який підписується відповідальними особами за підготовку цього обладнання. Якість підготовки обладнання контролюється представником відділу контролю якості. Обладнання маркують, вказуючи його готовність до роботи. Зберігати обладнання необхідно в чистому і сухому стані.

3.6.3. Вирощування біомаси штаму-продуцента R1

Проростки насіння женьшеню справжнього Panax ginseng CA Mеy тримісячного віку, інокулював агробактерій Agrobacterium rhizogenes A4. Пухлини, отримані на стеблах проростків в місцях інокуляції бактерій, переведені в стерильну культуру і є вихідним матеріалом для отримання калусу штаму R1. Насіння женьшеню справжнього Приморської популяції отримані з Зональної дослідної станції Всесоюзного інституту лікарських рослин (сел. Стара Варварівка Приморського краю).

Культуральні властивості. Зростаюча калусна культура являє собою тканину пухкої консистенції світло-зеленого кольору, рідше жовто-зеленого кольору без запаху. Ростової індекс культури 14 ± 2 по сирому вагою для калусів початковою масою 80 мг, вміст сухої речовини 5,3 ± 1,3% Живих клітин в середині експоненційної фази росту 90-94%

Спосіб культивування вирощування в накопичувальному режимі на агаризованому живильному середовищі за відсутності освітлення при температурі 25 ± 1оС, відносної вологості повітря 70 ± 10% на живильному середовищі наступного складу, мг / л води: NH4NO3350-450, KNO3 1500-2300 ,CaCl2 ,2H2O 400-480 ,MgSO4, 7H2O 350-400 ,KH2PO 150-190 ,H3BO3 4,2-8,0 ,MnSO4.4,H2O 15,6-26,7, CoCl2, 2H2O 0,02-0,03, CuSO4 ˙, 5H2O 0,02-0,03 ,ZnSO4 ,7H2O 6,0-10,3 ,Na2MoO4,2H2O 0,2-0,3 ,KJ 0,53-0,90, FeSO4,7H2O 25,0-30,6, Na2EDTA ,2H2O 33,6-41,0 ,тіаміну гідрохлорид 0,15-0,25 ,піридоксину гідро-хлорид 0, 4-0,6 ,нікотинова кислота 0,4-0,6, мезо-інозит 80-120, казеїну гідролізат 80-1204-,хлорофеноксі-оцтова кислота (А-СРА) 0,35-0,45 ,сахароза 23000-30000 ,агар 5800-6200рН ,середовища до автоклавування 5,6-5,8,каллус пасеруйте з інтервалом 30 діб. Номер пасажу 19-й.[13]

Цитологічна і каріологічна характеристики штаму. Тканина складається на 86-94% з клітин меристематичних типу круглої або овальної форми розміром в середньому 57 х 67 мкм, і з клітин паренхімних типу подовженої форми розміром в середньому 80 х 160 мкм. Крива мітотичної активності має одновершинний характер з максимумом на 9-й день культивування. Середнє число хромосом 56 ± 6 з варіацією від 24 до 190.Здатність до морфогенезу. Спостерігається рідко спонтанний ризогенез при збільшенні тривалості культивування калусыв в пасажі до 1,5-2,0 місяців.

Характеристика біосинтезу гінзенозидів. Штам продукує гінзенозиди (глікозиди дамароновой групи) Rg1, Re, Rf, NG-R2, Rb1, Rc, Rb2, Rd в кількостях, порівнянних з їх змістом до коренях плантаційний рослин. Гінзенозиди в середу культивування не виділяються. Загальний вміст гінзенозидів (Rg1, Re, Rf, NG-R2, Rb1, Rc, Rb2, Rd) у калусах штаму R1 4,3 ± 1,0 мг / г сухої маси.

У колби Ерленмейера ємністю 100 мл розливають по 30 мл живильного середовища наступного складу, мг / л води: NH4NO3400,KNO31900,CaCl2,2H2O 440,MgSO4,7H2O 370,KH2PO4170 ,H3BO36,2 ,MnSO4,4H2O22,3,CoCl2,2H2O 0,025,CuSO4,5H2O 0,025 ,ZnSO47,H2O 8,6 ,Na2MoO4,2H2O 0,25 ,KJ 0,83,FeSO4,7H2O 27,8,Na2EDTA ,2H2O 37,3 тіаміну гідрохлорид 0,2,піридоксину гідрохлорид 0,5 ;нікотинова кислота 0,5 ,мезо-інозит 100, казеїну гідролізат 1004,хлорофеноксі-оцтова кислота (4-СРА) 0,4 ,сахароза 25000 ,агар 6000,рН до автоклавування 5,6.[13].Колби із середовищем автоклавують при 117оС протягом 20 хв, потім охолоджують. На поверхню агару поміщають калус штаму R1 в кількості 0,5 г на кожну колбу. Культуру інкубують у темряві при 25оС і відносної вологості повітря 70% протягом 30 діб. Потім калус витягують з колб і зважують. Після ліофільної сушіння калусів в них визначають зміст гінзенозидів за методом, розробленим в Тихоокеанському інституті біоорганічної хімії ДВО АН СРСР (Маханьков В.В. Самошина Н.Ф. Малиновська Г.В. Атопкіна Л.М. Денисенко В.А. Ісаков В. В. Калиновський А.І. Уварова Н.І.) Аналіз глікозидів дамаранового ряду в природних і синтетичних сумішах методом високоефективної рідинної хроматографії. (Хімія природних сполук, 1990, N 1, с.57-61).Для цього суху біомасу штаму R1 вичерпно екстрагують 70%-ним водним метанолом. Отриманий упаренний екстракт розчиняють у 70% водному метанолі. Отриманий упаренний екстракт розчиняють у воді і послідовно екстрагують спочатку пентаном, а потім насиченим водою н-бутанолом. Бутанольна частина упарюють при зниженому тиску до постійної ваги, потім розчиняють у метанолі. Отриману суму гінзенозидів аналізують за допомогою мікроколончатого хроматографа "Міліхром" зі сталевими колонками 64 х 2 мм, заповненими сорбентом "Сферісорб" ОДС 5 мкм. Елююють градієнтом суміші ацетонітрил вода від 20:80 до 50:50. Час поділу 25 хв, витрата розчинника 2,5 мл. Детектування елюата здійснюють при 204 нм.

3.6.4 Пріготування живильного середовища

Завдання фахівця, оптимізуючого склад середовища для конкретного виду клітини, - вибрати такі джерела вуглецю, азоту, фосфору та інших речовин, які найбільш виправдані в економічному та екологічному відношеннях.

Принцип складання поживних середовищ. Кожен конкретний вид клітин, що використовуються в біотехнології, суворо вибірковий до живильних речовин. Потреба клітини в тих чи інших з'єднаннях визначається фізіологічними особливостями даного виду клітини, але у всіх випадках середовище має бути водним розчином цих речовин і забезпечувати в певній кількості їх приплив у клітку.

Найважливішою умовою приготування поживних середовищ є дотримання правил асептики. Для знезараження поживних середовищ застосовують, як відомо, хімічний вплив (дезінфекцію), вплив температури та інших фізичних факторів (ультразвуку, ультрафіолетових променів, ультрафільтрації). Кожен з цих методів вельми вибірковий. У біотехнології широко застосовують термічні методи знезараження поживних середовищ (автоклавування, стерилізацію, кип'ятіння тощо). Спори мікроорганізмів більш стійкі до високої температури, тому саме спори бактерій є лімітуючим фактором, що визначає температурні режими стерилізації середовищ.

Для стерилізації повітря в разі аеробних процесів культивування використовують фільтрування і ультрафіолетове опромінення

Постійним компонентом поживних середовищ є вода, в якій потребують всі живі клітини. Живильні речовини утворюють у воді істинні (мінеральні солі, цукру, амінокислоти, карбонові кислоти, спирти, альдегіди) або колоїдні (білки, ліпіди, неорганічні сполуки) розчини. Деякі компоненти поживних середовищ, що знаходяться в твердому агрегатному стані, можуть або утворювати придонний осад, або рівномірно розподілятися по всьому об'єму у вигляді суспензії, або плавати на поверхні розчину (частки вугілля). Рідкі вуглеводи при внесенні у воду утворюють незмішану фракцію.

В якості необхідних компонентів поживних середовищ можуть виступати гази: добре (КН3, Н2б), помірно (С02) або погано (1ч2, 02, Н2, СН4) розчинні у воді . Живильні середовища можуть мати невизначений склад, тобто включати біогенні добавки (рослинного, тваринного або мікробного походження), наприклад м'ясної екстракт, дріжджовий екстракт, кукурудзяну муку, морські водорості і т. д. Такі живильні середовища називаються натуральними. Застосовують також середовища, приготовані з чисто хімічних сполук у заздалегідь визначених співвідношеннях. Це так звані синтетичні середовища. Застосування знаходять і напівсинтетичні поживні середовища, що поєднують у своєму складі компоненти як натуральних, так і синтетичних середовищ.