Розділ 2. Целюлаза

1. Розповсюдження целюлозолітичних ензимів у природі

Природні продуценти целюлаз є серед багатьох організмів як прокаріотичного, так і еукаріотичного походження. Ендо – β – 1,4 – глюканази ряду бактерій та грибів поряд з іншими гідролітичними ензимами в основному беруть участь у деградації природної целюлози. Виділяють особливий клас організмів бактеріальних та грибних фітопатогенів, які реалізують свою целюлазну активність на перших етапах атаки рослин шляхом гідролізу рослинної клітинної стінки [2]. Функції целюлаз у рослині значно ширші та складніші, ніж просто деградація целюлози. У рослинах активація ендо –β–1,4–глюканаз відбувається на різних етапах росту та розвитку, однак механізми участі целюлоз у життєдіяльності рослин до кінця ще нез’ясовано.

Целюлозолітичні ензими продукуються багатьма бактеріями та грибами — аеробними й анаеробними, мезо та термофільними [3, 4]. Проте, лише незначна кількість грибів і бактерій синтезують високі рівні по заклітинної целюлази, яка здатна до гідролізу кристалічної целюлози [5, 6]. На цей час найбільш дослідженими є целюлозні системи аеробних грибів Trichoderma viride. [1]

2. Синтез целюлази

Найбільш повно вивчений продуцент Штам Trichoderma viride 44-11-62 / 3 здатний руйнувати кристалічну целюлозу. Однак цей штам, не дивлячись на позаклітинне продукцію ферменту, виробляє не найефективніший целлюлазний комплекс. Штам Trichoderma viride 44-11-62 / 3 продуцент Целюлозолітичних ферментів культивується в глибинних умовах на рідкому живильному середовищі. Штам інтенсивно продукує целюлозолітичні ферменти на поживних середовищах, що містять похідні целюлози або рослинні залишки. Целюлаза являє собою комплекс з трьох основних ферментів, що діють спільно:

Целлобіогідролаза (1,4-β-D-глюкацеллобіогідролаз);

Ендоглюканаза (ендо-1 ,4-β-D-глюканглюкогідролаза);

β-глюкозидаза

Целюлази гідролізують целюлозу з утворенням глюкози, целлобіози і олігосахаридів. Ендоглюконази діють першими на аморфні волокна целюлози. Це призводить до утворення невеликих волокон з вільними редукуючими і не редукуючими кінцями. Потім ендоглюконаза діють на вільні кінці волокон, в результаті чого утворюється целлобіоза, яка гідролізується β-глікозідази з утворенням кінцевого продукту - глюкози. При промисловому виробництві целюлаз застосовують традиційну схему виділення ферментів: екстракція водою водорозчинній частини культури; стабілізація целюлаз в розчині деякими солями; осадження целюлаз або їх часткове фракціонування органічними розчинниками; висушування вологих опадів. Агропромислові відходи давно застосовуються в якості додаткового джерела клітковини і як субстрати для росту мікроорганізмів-продуцентів целюлаз. Вуглеводними джерелами в промисловому виробництві целюлаз є: солома, відходи обмолоту злакових культур, пшеничні і рисові висівки, очеретяна меляса та відходи паперової промисловості. У ферментної промисловості для виробництва целюлаз застосовують в основному пшеничні висівки. Поряд з висівками в склади середовищ вводяться солодові паростки, які багаті вітамінами групи В, фосфором, клітковиною, легкозасвоюваними редукуючими речовинами і амінокислотами. До складу середовища також вводять рисову, вівсяну або ячмінну лушпиння, буряковий жом. Технологію отримання целлюлазного препарату целловиридин (Trichoderma viride 44-11-62 / 3) на 63 м3 ферментерах. Рекомендовано регламентне середовище для культивування,%:

Буряковий жом - 2,9;

Солодові паростки - 1,4;

Лактоза - 0,3;

Білотин - 0,2;

Сульфат амонію - 0,7;

Дигідрофосфат калію - 1,0;

Сульфат магнію - 0,05;

Целюлоза - 0,9.

Водневий показник середовища 5,5 pH.

Культивування проводять в безперервному режимі сім діб. Питома активність ферменту в культуральній рідині до 30 од / мл. Обсяг культуральної рідини 32 м3 при коефіцієнті завантаження 0,6. Недоліком даного способу для отримання целловіридина в промислових умовах на ферментерах об'ємом 63 м3 є те, що як джерело вуглецю у живильному середовищі застосовують буряковий жом. Він навіть після дроблення має пористу структуру, розбухає у воді і спливає, що призводить до утворення рясної піни. Це є причиною утворення заторів у технологічних трубопроводах. Для усунення затору технологічну операцію необхідно переривати. Крім цього, подібна обставина негативно позначається на роботі технологічного обладнання. Все це веде до значних механічних втрат, як живильного середовища, так і культуральної рідини і, отже, до низького виходу кінцевого продукту. Використання очищеної целюлози, для промислових процесів одержання целюлаз, позбавлене багатьох недоліків, але є витратним. Лактоза, целлобіоза, гентобіоза, є індукторами біосинтезу целюлози, але тільки застосування лактози економічно доцільно. [2]