147.Экспрессия чужеродной генетической информации в клетках бактерий, дрожжей, растений и животных.

Эффективность функционирования бактериальных генов не одинакова, что обусловливает вариабельность концентрации от-дельных белков в зависимости от их функций. Такие вариаций белков, например у Е. coli, обусловлены системой контроля ген ной экспрессии, осуществляемой в основном на уровне транс крипции ДНК, и зависят от количества синтезируемой на данно» гене мРНК и активности фермента РНК-полимеразы. Порядок чередовании нуклеотидных последовательностей в промоторно! участке структурного гена определяет степень активности РНК- полимеразы и инициацию процесса транскрипции. Бактериаль ные гены, включенные в геном, как правило, экспрессируютс? достаточно легко, давая мРНК и белок в силу того, что в сиг нальных последовательностях, управляющих процессами транс крипции и трансляции у различных прокариотических органиЗ мов, много общих черт. Что касается экспрессии генов эукариот бактериях, то она происходит крайне редко, если не создаваТ специальные условия, поскольку регуляторные участки эукариот отличны от таковых у бактерий. Регуляторные (сигнальные) участк не узнаются бактериальными РНК-полимеразами, что привода к замедлению транскрипции. При клонировании геномной ДНГ<, эукариотической клетки экспрессия генов не происходит изч отсутствия у бактерий системы сплайсинга. Следовательно, д! экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот необх| димо, чтобы данные гены находились под контролем прокари^ тических регуляторных элементов. В связи с этим для осуществл ния экспрессии эукариотического гена соответствующая кДЙ (или синтетическая ДНК), содержащая кодирующую последов тельность, в составе векторной молекулы (например, плазмида присоединяется к регуляторным элементам бактери и - промотор оператору и рибосом-связывающему участку.

Таким образом, в сконструированных промежуточных река бинантных ДНК эукариотический ген будет находиться под ко!§ ролем бактериальных регуляторных элементов. Целесообразй встраивать ген в подходящий вектор для экспрессии, который f содержит регуляторные элементы, способствующие активной экс-прессии встроенного гена после введения рекомбинантной плаз¬миды в бактериальную клетку. Например, к таким эффективным регуляторным участкам принадлежит промотор гена р-лактамазы (ген устойчивости к ампициллину, входящий в состав плазмиды pBR322). Промотор гена Р-лактамазы нерегулируемый, а исполь¬зование таких промоторов не всегда удобно, так как синтезиро¬ванные белки в большом количестве могут блокировать рост бак¬терий. В связи с этим целесообразнее использовать регулируемые сильные промоторы, включить которые для синтеза чужеродного белка можно и в том случае, когда получена большая бактериальная масса. В частности, к числу регулируемых сильных промоторов сле­дует отнести термочувствительный промотор pL, который ответ­ствен за экспрессию нескольких генов бактериофага. Белок-ре- прессор, блокирующий данный промотор, активен при 31 "С, но неактивен при 38 "С, следовательно, при инкубировании бакте­рий при 31 °С чужеродный ген не экспрессируется и, наоборот, повышение температуры вызывает инактивацию репрессора и вы­сокий уровень синтеза нужного белка.

Последовательность оснований длиной 6 — 8 нуклеотидов, рас­положенная непосредственно перед инициирующим кодоном АУТ у Е. coli, определяет эффективность процесса трансляции. Эта пос­ледовательность представляет собой участок связывания мРНК с рибосомой, и его сдвиг в ту или иную сторону способен умень­шать эффективность трансляции мРНК. По имени исследовате­лей, идентифицировавших этот участок, он был назван последо­вательностью Шайн-Дальгарно. Обычно эту последовательность включают в состав самого вектора вместе с инициирующим кодо­ном на нужном расстоянии. При экспрессии векторов такого типа образуется гибридный белок, в котором несколько N-концевых аминокислотных остатков происходят от источника регуляторных элементов и инициирующего кодона прокариотического гена. Та­кие гибридные белки часто более стабильны; обработка их хими­ческим или ферментативным способом приводит к выделению эукариотической части белка.

Суммарная активность экспрессируемого гена возрастает с ро­стом числа копий рекомбинантной ДНК в расчете на клетку. Ис­пользуя многокопийные плазмиды, можно получить сверхсинтез нужных белковых продуктов. Получены температурно-чувствитель- ные мутантные плазмиды, способные накопить до 1 — 2 тыс. ко­пий на клетку без нарушения жизненно важных функций бакте­рий. Обычно же используемые плазмидные векторы поддержива­лся в клетке в количестве 20 — 50 копий. Получение бактериаль­ных штаммов-сверхпродуцентов плазмидных генов — одна из важ­нейших задач современной биотехнологии в экономическом, ме­дицинском и социальном аспектах.