131.Свойства нитевидных фагов, позволяющие им выступать в качестве векторов

Э. Коли. При клонировании и амплификации в векторных плазмидах или производных фага лямбда чужеродные фрагменты ДНК находятся в двухцепочечной форме. Однако в ряде случаев, например при направленном мутагенезе, необходимо манипулировать с одной цепью ДНК. При этом приходится разделять цепи ДНК, что не всегда просто. Поэтому клонирование ДНК в одноцепочечных векторах является привлекательным объединением процедур изолирования целевой последовательности ДНК, ее амплификации и разделении цепей исходного двуцепочечного фрагмента. Нитевидные фаги Э. Коли (М13, fd, fl) наиболее подходят для этой цели. Длинные, тонкие и гибкие вирионы этих фагов представляют собой кольцевую, одноцепочечную ДНК. Простая организация – небольшой размер генома(максимум 8 генов). Высока плодовитость. Непостоянство размеров.

Нитевидные фаги адсорбируются на F-пи-лях Е. coli и поэтому способны инфицировать лишь мужские (F+) бактериальные клетки.

132. Векторы на основе генома нитевидных фагов.

С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 т.п.н. Однако при создании геномных библиотек часто приходится работать с более крупными фрагментами. Для этого были разработаны векторы на основе бактериофага λ Escherichia coli.

После проникновения фага λ в клетку Escherichia coli события могут развиваться по двум сценариям. Если реализуется литический цикл, то фаг начинает интенсивно размножаться и примерно через 20 мин. клетка разрушается (лизируется) с высвобождением до 100 новых фаговых частиц. При альтернативном варианте развития событий фаговая ДНК включается в хромосому Escherichia coli как профаг и реплицируется в клетке вместе с нормальными бактериальными генами.

В результате исследований по изучению сборки фага λ была разработана система упаковки малекул ДНК in vitro с образованием инфекционных фаговых частиц. Смешав в пробирке очищенные пустые головки, фаговую ДНК и собранные отростки, можно получить инфекционные фаговые частицы.

Нитевидные фаги Е. coli (М13, fd, fl) наибо-лее подходят для этой цели. Длинные (900 нм),тонкие (7 нм) и гибкие вирионы этих фаговпредставляют собой кольцевую одноцепочеч-ную ДНК (оцДНК) длиной 6407 нуклеотидовдля фага М13 и 6408 нуклеотидов для фагов fdи fl. ДНК упакована в трубочку, состоящую из2700 копий основного оболочечного белкаpVIII и закрытую на концах четырьмя илипятью молекулами каждого из четырех минор-ных оболочечных белков pill, pVI, pVII и pIXНитевидные фаги адсорбируются на F-пи-лях Е. coli и поэтому способны инфицироватьлишь мужские (F+) бактериальные клетки. Ин-фекция клеток Е. coli начинается после адсорб-ции белка рШ, входящего в состав фаговых час-тиц, на конце F-пили хозяйской клетки. Послеэтого оцДНК фага, называемая (+)-цепью, пере-носится в цитоплазму клетки. Бактериальныеполимеразы осуществляют синтез второй,(-)-цепи, образуя двухцепочечную реплика-тивную форму (РФ) фагового генома.

133. Особенности трансформации грамотрицательных и грамположительных бактерий

Трансформация - разновидность рекомбинативной изменчивости микроорганизмов, сопровождающаяся переносом ДНК от донора к реципиенту через окружающую среду. В процессе трансформации ДНК-фрагмент погибшей и разрушенной бактерии встраивается в ДНК реципиента, находящегося в состоянии компетенции. Впервые продемонстрирована в 1928 г. Фредериком Гриффитом. Описана как у грамположительных, так и грамотрицательных бактерий родов Bacillus, Haemophilus, Neisseria, Escherichia, Pneumococcus. Для осуществления трансформации необходимы следующие условия:

l. Наличие небольшого (до 20 генов) фрагмента двухцепочечной ДНК донорской клетки. Одноцепочечные или меньшего размера ДНК быстро разрушается нуклеазами окружающей среды.

2. Наличие реципиента, находящегося в состоянии компетенции. В естественных условиях захват ДНК клеткой-реципиентом осуществляется в фазу логарифмического роста, когда продуцируется специфические ДНК-связывающие белки, кодируемые com-генами. Состояние проницаемости бактериальных мембран для ДНК называют компетенцией. В лабораторных условиях компетенцию достигают путем обработки химическими веществами, например, добавлением CaCl2 в культуру.

^ Стадии трансформации. На первой стадии трансформации происходит захват ДНК клеткой-рецепиентом. У грамотрицательных микроорганизмов (например, N. gonorrhoeae) ДНК присоединяется к поверхности бактерии и поступает в ее цитоплазму по каналу, пронизывающему наружную мембрану, пептидогликан, периплазматическое пространство и цитоплазматическую мембрану. В области наружной мембраны канал состоит из белка-пиллина PilQ, в пептидогликане и периплазматическом пространстве из Pil E и ДНК-связывающего белка Com E, в цитоплазматической мембране - из белка Сom A. Перед поступлением в канал, состоящий из белка Сom A, одна из двух нитей ДНК разрушается нуклеазой. У грамположительных микроорганизмов (например, B. subtilis) нет наружной мембраны, и потому транспорт происходит только через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану. В клеточной стенке для прохождения ДНК формируется канал из белка Сom GC и ДНК-связывающего протеина Com EA. На уровне цитоплазматической мембраны одна из нитей ДНК разрушается нуклеазой, а вторая транслоказой Com FA транспортируется по каналу из белка Сom ЕС в цитоплазму. ^ На второй стадии трансформации происходит реципрокный обмен между донорской и реципиентной ДНК, называемый гомологичной рекомбинацией. Рекомбинация требует сходства между генетической информации донора и реципиента и наличия генов бактериальной рекомбинации - recA, B и C. В редких случаях возможна рекомбинация между отдаленными видами.

Значение. В естественных условиях трансформация приводит к усилению вирулентности. Используется в микробиологической науке для конструирования генетически модифицированных микроорганизмов, изучения функций генов.

У грамотрицательных есть дополнительная мембрана, поэтому нужны специальные каналы.