123. Принципы конструирования векторов.

Конструирование клонирующих векторов подразумевает встраивание или удаление удобных для идентификации клонов генетических элементов (специфических сайтов рестрикции, инициации и регуляции транскрипции). Например, при создании плазмидных клонирующих векторов ослабляют систему контроля репликации и добавляют или вырезают гены антибиотикоустойчивости. При формировании фаговой векторной конструкции экзогенную ДНК встраивают в район локализации маркерного гена, позволяющего вести селекцию химерных фагов по экспрессии химерного белка (часть полипептидной цепи соответствует маркерному белку, а часть -информации, заключенной во встроенном фрагменте ДНК). Определение химерного белка возможно при использовании антител к фрагменту маркерного белка или участку, кодируемому чужеродной ДНК, а также путем выявления функционально активного белка после протеолитического расщепления химерного полипептида. При конструировании искусственных дрожжевых хромосом YAC (от англ. yeast artificial chromosomes) используют плазмидные векторы, содержащие в своем составе известные центромерные и теломерные последовательности хромосом дрожжей, необходимые для поддержания репликации векторов в клетках хозяина. Характеристики клонирующих векторов представлены в таблице.

Конструирование вектора. Сама по себе кассета экспрессии не может попасть в клетку-реципиент и интегрироваться (внедриться) в хромосомы растения-хозяина. Для этого нужен вектор — специальная молекула ДНК, которая может проникать в клетки растений и там самореплицироваться, либо встраиваться в ДНК хозяина и реплицироваться вместе с ней.

Любой полноценный в функциональном отношении ген, в том числе и рекомбинантный, состоит из регуляторной и структурной частей. Генетический код, с помощью которого последовательность нуклеотидов в кодирующей структурной части гена определяет последовательность аминокислот в кодируемом этим геном белке, универсален для всех организмов. Это дает принципиальную возможность получения полноценной экспрессии самых разнообразных осмысленных последовательностей нуклеотидов, в том числе и искусственно синтезированных, в любом природном генетическом окружении.

Регуляторная часть генов распознается соответствующими ферментными системами организма и обеспечивает экспрессию его структурной части. Регуляторная часть гена высокоспецифична в отношении природных генетических эффекторов (РНК-полимераз, рибосом, факторов транскрипции и трансляции, белковых факторов сплайсинга, ферментов, осуществляющих посттрансляционные модификации полипептидов, и т.п.), и чаще всего она не может эффективно функционировать в гетерологичном генетическом окружении. При конструировании экспрессирующих векторов необходимо учитывать особенности структуры регуляторной части рекомбинантного гена, исходя из того, в каких генетических условиях клонированный ген предполагается экспрессировать.

Не только регуляторные последовательности генов являются препятствием для экспрессии чужеродных рекомбинантных генов. Структурные части генов про- и эукариот отличаются друг от друга по наличию у последних внутри генов многочисленных и протяженных некодирующих последовательностей нуклеотидов - интронов.

Следовательно, гены эукариот не могут эффективно экспрессироваться в клетках прокариот, поскольку у прокариот отсутствуют соответствующие системы сплайсинга. Кроме того, у предшественников эукариотических мРНК не может осуществиться в бактериальных клетках и правильный процессинг 3'- и 5'-концевых некодирующих последовательностей.