121. Типы векторов: плазмидные и фаговые векторы(в) природного и искусственного происхождения.

Плазмиды -- это внехромосомные автономно реплицирующиеся 2цепоч кольц молекулы ДНК. Это монорепликонные структуры. П. есть практически у всех бактерий. Одни из них содержат инф-ю, обеспечив их собственный перенос из одной кл в другую (F-плазмиды). F-плазмида имеет tra-оперон(придаёт клеткам «мужские» свойства), ц2 и ц3 последовательности. Ц2 и ц3-мигрирующие генетические элементы(перемещаются их копии). Получена Жакобом и Вольманом. R-плазмиды несут гены уст-ти к антибиотикам. Похожи на половой фактор. Множественные R-плазмиды трансмиссибельны. Обладают шир кругом хозяев (бактерии:сальмонелла, ризобиум, эррвиния). Пример – RP-4 плазмида. R-плазмида не взаимодействуют с хромосомой  исследователи исп-ли бактериофаг μ-транспозон. Его геном не имеет точки origin  не реплицируется. При попадании в клетку встраивается в хромосому (в любом месте). Размножается за счёт перетранспозиции как бы реплицируется. Может осуществлять трансдукцию. Плазмиды деградации несут специфические наборы генов, ответственных за утилизацию необычных метаболитов. Есть плазмиды, в которых не обнаружены гены, выполняющие какие-то определенные функции (критические плазмиды). Размеры плазмид варьируют от менее 1 до более 500 т.п.н. Кажд из них содержит сайт нач репл-и (ori), без которого репликация плазмиды в клетке-хозяине была бы невозможна. Нек плазмиды представлены в клетке 10—100 копиями; они называются высококопийными. Низкокопийные плазмиды присутствуют в клетке в числе 1—4 копий. Как автономно реплицирующиеся ген. элементы плазмиды обладают всеми основными св-ми, которые позволяют использовать их в качестве вектора для переноса клонируемой ДНК. Но довольно часто природ (немодифицированные, несконструированные) плазмиды бывают лишены некоторых обязательных для «высококачественного" вектора свойств. К таким важным свой-м относятся: 1 ) небольшой размер, поскольку эффективность переноса экзогенной ДНК в Е. coli значительно снижается при длине плазмиды более 15 т. п. н.; 2) наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть осущ вставка; 3) наличие одного или более селективных ген маркеров для идентификации реципиентных кл-к, несущих рекомб ДНК. Поэтому плазмид векторы приходится создавать с помощью генной инженерии. Фаговые вектора. Используются для работы с более крупными фраг-ми. Для этого были разработаны В-ы на основе бактериофага λ Ε. coli. После проникновения фага λ в клетку E. coli может реализоваться литический цикл-фаг начинает интенсивно размножаться и примерно через 20 мин клетка разрушается (лизирует) с высвобождением до 100 новых фаговых частиц. При альтернатив варианте развития событий фаг ДНК включ в хромосому Е. coli как профаг и реплицируется в клетке вместе с нормальными бактер генами (состояние лизогении). Однако при недостатке пит в-в или иных неблагопр обстоятельствах интегрированная фаговая ДНК высвобождается, и запускается литич цикл развитии. Размер ДНК фага λ составляет примерно 50 т. п. н., причем значительная ее часть несущественна для размножения фага и отвечает за его встраивание в хозяйскую ДНК. В связи с этим возникла идея, что ее можно заменить фрагментом другой ДНК эквивалентного размера. Образующаяся рекомбинантная молекула будет реплицироваться в клетке как ДНК «рекомбинантного» фага λ, «вставшего» на литический путь развития. При исключении из хромосомы может захватываться часть генома (лактозный оперон). Можно получать фаговые частицы несущие почти любой элемент генома бактерий. Возможность создания В-ов на основе фага λ связано с тем, что гены центральной части не существенны для литического развития. При использ фага есть необходимость удалять лишние сайты рестрикции. Используют вектор с одним сайтом для крупнощепящей рестриктазы – В-ы внедрения (сюда вставляют чужеродный фрагмент). Для увеличения ёмкости сконструированы Вы замещения. Здесь между левым и правым плечами фаговой ДНК есть балластный фрагмент, ограниченный сайтами для крупнощепящих рестриктаз. Потом балластный фрагмент удалятся и заменяется на клонируемый.