115.Метод создания гомополимерных окончаний при получении рекомбинантных молекул днк.

Коннекторный метоо. Этот метод позволяет объединять любые двунитевые фрагменты ДНК путем ферментативного наращивания на их концах однонитевых комплементарных участков (рис. 8.3). Именно с его помощью была сконструирована первая рекДНК (Jackson et al., 1972), положившая начало генетической инженерии. Суть данного процесса сводится к следующему. Фрагменты ДНК и линеаризованный вектор с концами любого строения обрабатывают экзонуклеазой фага А для "обнажения" 3' концов. Это облегчает течение последующей реакции, когда терминальная дезоксирибонуклеоткдилтрансфераза наращивает на З'-концах фрагментов однонитевые гомополимерные участки из 10—30 звеньев, используя добавленный в среду определенный де- зоксирибонуклеозидтрифосфат. Если синтезированные участки у разных фрагментов состоят из комплементарных нуклеотидов, то фрагменты могут объединяться с их помощью. В местах соединения фрагментов из-за неодинаковой длины гомополимерных "хвостов" получаются однонитевые бреши или избыточные однонитевые концы. Ранее эти дефекты исправлялись in vitro репарационными ферментами — ДНК-полимеразой I, экзонук-леазой III и ДНК- лигазой, после че,го образовавшимися рекДНК трансформировали реципиентные клетки.

Самым простым вектором можно считать плазмиду кишечной палочки, относящуюся к группе колициногенных факторов, детерминирующих у кишечной палочки синтез антибиотика колимицина. Из кольцевой плазмида превращается в линейную структуру, в которой имеются "липкие" концы по отношению к фрагментам чужеродной ДНК. Липкие концы должны иметь комплементарные основания, они соединяются водородными связями независимо от структуры и происхождения ДНК. Затем с помощью ферментов - лигаз образуется плазмида, которая называется рекомбинантной (с включенным участком чужеродной ДНК). Описанная процедура, в ходе которой чужеродная ДНК встраивается между двумя концами плазмидной ДНК с помощью фермента, называемого ДНК-лигазой, достигается методом ГОМОПОЛИМЕРНЫХ КОНЦОВ.

Метод гомополимерных концов основан на присоединении к 3' - концам цепей, образующих двуцепочечную ДНК, коротких отрезков одноцепочечной ДНК с регулярной последовательностью (гомополимерных). Если каждый подобный гомополимер состоит из нуклеотидов одного вида и если два таких гомополимера с взаимно комплементарными основаниями присоединены соответственно к плазмиде и к ДНК, то последние, оказавшись рядом, замкнутся друг на друга с образованием рекомбинантной плазмиды.

В простейших макромолекулярных цепях все звенья одинаковые - такие цепи наз. гомополимерными; к этому классу относится большинство распространённых синтетич. макромолекул.

116. Использование линкерных полинуклеотидов в технологии клонирования днк.

Рестриктазно-лигазный метод

1) рестриктазой класса II специфически разрезают молекулы ДНК на фрагменты, имеющие идентичные взаимокомплементарные липкиеконцы;

2) препараты различных молекул ДНК, гид-ролизованных одной и той же рестриктазой,смешивают, и при определенных условиях лип-кие концы разных фрагментов ДНК реассоции-

руют за счет комплементарного взаимодействия;

3) с помощью ДНК-лигазы происходит ко-валентное связывание ассоциированных фраг-ментов ДНК.По такой схеме могут быть ковалентно сое-динены in vitro два и более любых фрагмента,полученных при гидролизе молекул ДНК однойи той же рестриктазой. Однако с помощью

рестриктаз (особенно одного фермента) в каж-дом конкретном случае можно получить лишь специфический, строго определенный наборфрагментов изучаемой ДНК. Первоначальноэто в некоторой степени ограничивало приме-нение рестриктазно-лигазного метода. Но затемполучила распространение новая его модифи-кация, основанная на использовании линкер-ных молекул — синтетических сегментов ДНК,содержащих в своем составе последовательнос-ти, узнаваемые рестриктазами. Метод предло-жили Р. Шеллер с сотрудниками в 1977 г. Онпозволяет достаточно просто рекомбинироватьin vitro практически любые фрагменты ДНК.

Разработанный подход включает следущиеоперации

1) по тупым или липким концам фрагментаДНК, который предполагается рекомбиниро-вать, с помощью лигазы фага Т4 пришиваюткороткие синтетические двухцепочечные сег-

менты, имеющие участки узнавания определен-ной рестриктазы;

2) полученный фрагмент обрабатывают вы-бранной рестриктазой, в результате чего обра-зуются липкие концы;

3) полученный фрагмент рекомбинируютin vitro с другими молекулами ДНК по обычнойсхеме рестриктазно-лигазного метода. Использование линкерных молекул делает рестриктазно-лигазный метод рекомбинации фрагментов ДНК in vitro универсальным, по-скольку исходные фрагменты можно получатьсамыми различными способами.

При отсуствии комплементарных липких концов у сшиваемых фрагментов их достраивают, т е синтезируют искусственно-ферментативным путем. Для этой цели применяют линкеры (переходники) – короткие участки ДНК, имеющие липкие концы. Линкерные фрагменты не только обеспечивают обьединение генов, но и обусловливают их экспрессию, в связи с чем часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторно-генетический элемент, наприм промотор или участок, связывание с рибосомой.

Для получения линкеров синтезируют олигомеры, которые представляют собой одноцепочечные нуклеотидные последовательности, спаривающиеся между собой. Линкеры содержат сайты узнавания для рестректирующих эндонуклеаз, что позволяет осуществлять с их помощью клонирование фрагментов ДНК. Разрезают новую молекулу нужной эндонуклеазой и получают фрагменты с выступающими одноцепочечными концами (липкими концами), с помощью которых встраивают ДНК-мишень в соответствующий вуктор. Прежде чем проводить встраивание, рестрекцированную смесь фракционируют для отделения ДНК с липкими концами от лишних линкерных молекул. Вектор тоже обрабатывают рестриктазой и сшивают с помощью ДНК-лигазы и фага Т4.