101. Инструменты генетической инженерии

Инструментами генетической инженерии являются ферменты и векторы (плазмиды).

Ферменты:

• Рестриктазы

• Обратная транскриптаза (может образовывать копии ДНК)

• Лигазы (сшивают ДНК)

• Ферменты изменяющие структуру концов ДНК

• ДНК-полимеразы (достраивают ДНК)

• Щелочные фосфотазы (не дают смыкаться концам ДНК)

• Ферменты для получения радиоактивных зондов.

102. Принципы создания рекомбинантных молекул in vivo.

Этапы: 1) необходим вектор, обладающий определенными свойствами: быть репликоном(иметь точку О) 2)должен быть механизм для фрагментации геномов (за сет рекомбинации систем) 3)гены должны экспресироваться. Генная иженерия in vivo ограничена прокариотами.

Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой соединенные в бесклеточной системе два компонента: вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой («чу­жеродной») ДНК, содержащий интересующие исследователя гене­тические элементы. Согласно определению национальных институ­тов здоровья США, «рекомбинантными ДНК называют молекулы ДНК, полученные вне живой клетки путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться в клетке».

103. Поняте о репликоне. Основные типы репликонов

Репликон- структура, способная самостоятельно реплицироваться (хромосомы и плазмиды бактерий). Каждый репликон в процессе клеточного деления активируется 1 раз, независимо от того, содержит клетка только одну хромосому (как у прокариот) или несколько ( эукариоты).

Репликон должен обладать структурными элементами:

а) точка начала репликации (origin), в которой инициируется пр-с удвоения ДНК

б) точка окончания репликации (terminus), в которой пр-с удвоения ДНК останавливается.

Репликация контролируется на стадии инициации, т.к. начавшись этот процесс продолжается до тех пор, пока весь репликон не удвоится.зн, скорость репликации генома регулирется частотой инициирующих событий.

Частота, с которой происходит инициирование репликации, контролируется регуляторным белком или белками, способными взаимодействовать с точкой начала репликации.

- репликон прокариот – любая молекула ДНК, которая содержит точку начала репликации, способна самостоятельно реплицироваться в клетке.

- репликон эукариот- единица репликации, содержащая только 1 точку начала начала репликации, при этом любой необходимый белок м.быть продуктом другой контролирующей единицы. Бактериальная хромосома содержит 1 репликон и 1 точку начала репликации, поэтому инициация репликации в этой единственной точке приводит к репликации всего генома.

Эукариотическая хромосома содержит большое число репликонов. За 1 клеточный цикл все репликоны должны быть активированы, но эта активация начинается не одновременно. Каждый из репликонов должен быть активирован1 раз. В клетке должен сущесьвовать определенный сигнал, позволяющий отличать реплицированные репликоны от нереплицированных и показывающий завершение всего процесса.

104.Рестрицирующие эндонуклеазы, их основные характеристики область применения

Рестрикция обусловлена расщеплением инфицирующей ДНК фага под действием фермента, специфичного для штамма-хозяина. Ферменты эти получили название рестрикционных эндонуклеаз или рестриктаз. Бла-годаря своему нуклеазному действию они препятствуют поддержанию чужеродной ДНК в бактериальной клетке. Если фаг проделал полный цикл репродукции в новом хозяине (в на-шем примере штамм E. coli C), то в дальнейшем в этом же хозяине он не подвергается ограничению, или рестрикции. Объяснить подобные факты можно следующим образом. В бактериальной клетке, кроме рестриктаз, синтезируются другие ферменты – метилазы, которые призваны защи-щать собственную ДНК от действия клеточных рестриктаз. Метилазы изменяют или модифицируют собственную ДНК путем метилирования или гликозилирования аденина либо цитозина. Этот процесс известен под названием модификации. ДНК бактериофага, прошедшего полный цикл развития в новом хозяине, под действием метилаз модифицируется таким же образом, как и ДНК клетки-хозяина. Она метилируется и при-обретает свойства, защищающие ее от воздействия рестрикционных ферментов данного штамма бактерий.

Следовательно, работающая в клетках бактерий система рестрикции-модификации (система R-M) образована двумя специфическими для оп-ределенного штамма микроорганизма ферментами – ДНК-модифици-рующим (аденин- или цитозинметилаза) и расщепляющим (рестриктаза).

Эти ферменты узнают в ДНК одни и те же определенные короткие по-следовательности нуклеотидов – сайты. Метилаза, модифицируя опре-деленные основания внутриклеточной ДНК, защищает ее от действия ре-стриктазы, узнающей ту же нуклеотидную последовательность.

Системы рестрикции и модификации широко распространены среди бактерий и найдены практически у всех исследованных видов. Недавно рестриктазы обнаружены и у некоторых видов дрожжей. Из разных штаммов микроорганизмов выделяют рестриктазы, различающиеся меж-

ду собой характером действия на ДНК.

В настоящее время все известные рестриктазы в зависимости от потребно-сти в кофакторах и характера расщепления нуклеотидных последова-тельностей ДНК разделяют на три типа: I, II и III.

Рестриктазы I типа являются сложными белками с тремя различ-ными типами субъединиц (эндонуклеаза, метилаза, фермент узнавания). Для действия этих ферментов в качестве кофакторов требуются АТФ, S-аденозинмонофосфат и ионы Mg2+. Расщепление ДНК совмещено с

гидролизом АТФ. Рестриктазы I типа узнают сайт рестрикции, но расще-пляют последовательность ДНК на произвольном расстоянии от сайта узнавания (от нескольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеоти-дов). В результате образуются самые разнообразные фрагменты ДНК,

или рестрикты. Такие рестриктазы невозможно использовать для реше-ния генно-инженерных задач.

Системы рестрикции и модификации II типа представлены двумя от-дельными белками (рестрикционная эндонуклеаза, модификационная метилаза). Рестриктазы II типа – относительно просто организован-ные белки, состоящие из двух субъединиц одного типа со сравнительно

небольшой молекулярной массой. Для специфического действия этих ферментов нужны только ионы Mg2+

. Рестриктазы II типа характеризу-ются тем, что у них сайты узнавания и места рестрикции совпадают.

Обычно рестриктаза II типа узнает определенную последовательность ДНК и вызывает ее разрыв внутри этой последовательности. Сайты рест-рикции рестриктаз II типа представлены симметричными при повороте

на 180º последовательностями – палиндромами.

Рестриктазы II типа делятся на несколько классов в зависимости от размера сайта рестрикции и длины получаемых фрагментов ДНК:

1) мелкощепящие – сайт рестрикции представлен 4 п.н.;

2) среднещепящие – сайт рестрикции – 6–8 п.н.;

3) крупнощепящие – сайт рестрикции – 10–14 п.н.

Рестриктазы II типа делятся на две группы в зависимости от того, ка-ким образом они расщепляют последовательность ДНК. Одни из них осуществляют прямой разрез ДНК (по оси симметрии). В результате образуются фрагменты ДНК с тупыми или ровными концами. Примером таких рестриктаз является эндонуклеаза BalI.

Рестриктазы, относящиеся ко второй группе, осуществляют ступен-чатый разрез (на некотором расстоянии от оси симметрии). В результате этого в месте разреза образуются неровные, или липкие, концы, т. е. ре-стрикты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные

участки. Примером таких рестриктаз является фермент EcoR1:

Рестрикты, полученные после воздействия на разные молекулы ДНК определенной рестриктазы, имеют одинаковые липкие концы. Такие ре-

стрикты могут объединяться друг с другом с образованием рекомбинант-ных молекул ДНК, что широко используется в генетической инженерии.

Рестриктазы III типа имеют некоторое сходство с рестриктазами I типа. Фермент состоит из двух различных субъединиц (эндонуклеаза, метилаза), и поэтому бифункционален, т. е. обладает как рестриктазной, так и метилазной активностью. Для проявления эндонуклеазной актив-

ности требуются только АТФ и ионы Mg2+. Расщепление ДНК не сопро-вождается гидролизом АТФ. Рестриктазы III типа гидролизуют ДНК на

расстоянии 20–39 п.н. от сайтов узнавания и поэтому также довольно редко используются для практических целей.

Ферментативная активность рестриктаз измеряется в единицах ак-тивности. Это такое количество фермента, которое необходимо для пол-ного гидролиза за один час 1 мкг ДНК фага λ при оптимальных услови-ях. Оптимальные условия рестрикции для каждой рестриктазы являются

индивидуальными и зависят от рН, ионной силы раствора, присутствия определенных ионов, температуры проведения реакции.