78. Принципы подбора питательных сред для культивирования микроорганизмов, клеток животных и растений.

Превалирующим компонентом всех (или почти всех) биотехнологических процессов является вода. В лабораторных условиях можно легко определить специфические потребности любого конкретного организма и затем экстраполировать на производственный уровень.

Если процесс крупномасштабный, то важным моментом будет доступность субстрата для культивирования (наличие его в требуемых количествах, стабильность, восполняемость, легкость в обращении и сохранении). Стоимость материалов является важным фактором. Неотъемлемым фактором является здоровье работников, особенно при манипуляциях с порошковыми материалами.

Среды неподходящего состава обусловят низкий уровень ростовых процессов и, следовательно, низкий уровень выхода целевого продукта.

Питательные среды для выращивания объектов биотехнологии, т. е. продуцентов тех или иных соединений, могут быть неопределенного остава и включать различные биогенные добавки (растительные, животные или микробные) – мясной экстракт, кукурузную муку, морские водоросли и т. п. Применяются также среды из чистых химических

соединений определенного состава, так называемые синтетические. Компонентный состав сред определяется питательными потребностями продуцента. Во многих процессах используют в качестве объектов организмы, ранее называвшиеся гетеротрофами, которые в

настоящее время подразделяются на: органо автотрофы (употребляющие органические вещества как источники энергии), литогетеротрофы (использующие органические вещества как источники углерода) и органогетеротрофы (для которых органические вещества служат и

источниками энергии, и источниками углерода). Питательные среды призван обеспечивать жизнеспособность, рост и

развитие соответствующих продуцентов, а также синтез целевого продукта с максимальной эффективностью. Требования к питательным средам, используемым в биотехнологии, ничем не отличаются от требований, предъявляемым к питательным средам, применяемым в микробиологии для культивирования тех или иных микроорганизмов. Для приготовления питательных сред в биотехнологии используютсяразнообразные субстраты, которые должны удовлетворять определенным критериям. Субстрат представляет собой сырье для получения целевого продукта и должен быть недефицитным, дешевым, по возможности легко доступным.

79. Конечные стадии получения продуктов биотехнологических процессов

Завершающие стадии биотехнологических процессов – выделение целевого продукта – существенно различаются в зависимости от того, накапливается продукт в клетке или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является клеточная биомасса. Наиболее

сложным является выделение внутриклеточного продукта. При этом клетки необходимо отделить от среды культивирования, подвергнуть их разрушению, а затем целевой продукт очистить от остатков разрушенных клеток.

Выделение продукта существенно облегчается, если он экскретируется продуцентом в культуральную жидкость. Поэтому одной из насущных задач биотехнологии является создание промышленных штаммов микроорганизмов, секретирующих возможно большее число ценных продуктов в значительных количествах.

Технология выделения и очистки в значительной степени определяется природой целевого продукта. В ряде случаев существует возможность не использовать тщательную очистку продукта, если он обладает требуемыми активностями в неочищенном состоянии и если примесь посторонних веществ не оказывает каких-либо нежелательных влияний при его использовании. Некоторые традиционныебиотехнологические процессы вообще исключают этап отделения продукта.

существенно различаются в зависимости от того: а)накапливается продукт в клетке, или б) выделяется в культуральную жидкость, или в) продуктом является клеточная биомасса. Наиб. сложным является выделение внутриклеточного продукта. Выделение продукта облегчается, если он экскретиру-ется продуцентом в культуральную жидкость.

Отделение биомассы

Первым этапом в процессе очистки целевого продукта является разделение культуральной жидкости и клеточной биомассы — сепарация. методы сепарации:

1. Флотация- используется, если клетки продуцента в силу низкой смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях содержимого биореактора. (флотаторы) различной конструкции удаляют образующуюся при культивировании пену вместе с прилипшими к пузырькам газа клетками.. Достоинства: экономичность, высокая производительность и возможность использования в непрерывных процессах.

2. Фильтрация- задержка биомассы на пористой фильтрующей перегородке. Недостаток: налипание клеток на фильтре,его забивание.

3. Центрифугирование- требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование, поэтому он применяется если: а) суспензия фильтруется слишком медленно; б) возникает необходимость максимального освобождения культуральной жидкости от содержащихся в ней частиц; в) требуется обеспечить непрерывный процесс сепарации, когда фильтры рассчитаны на периодическое действие.

Иногда используют 2+3.

Методы разрушения клеток

Разрушение клеток проводится физическими, химическими и ферментативными методами. Наиб. пром. значение имеют физические способы: 1) ультразвук; 2) лопаточными или вибрационными дезинтеграторами - метод, обычно используемый в пилотных и промышленных установках; 3) встряхивание со стеклянными бусами; 4) продавливание через узкие отверстия под высоким давлением; 5) раздавливание замороженной массы; 6) растирание в специальных ступках; 7) осмотический шок; 8) многократное замораживание и оттаивание; 9) сжатие клеточной взвеси с последующим резким снижением давления (декомпрессией).Физические способы: большая экономичностью, отсутствием выраж. специфичности, вследствие чего обработка может отрицательно влиять на качество получаемого целевого продукта.

Концентрирование продукта — обратный, ультрафильтрация и выпаривание.

Обратный осмос- концентрируемый раствор помещается в мешок из полупроницаемой мембраны, снаружи создается осмотическое давление, превышающее осмотическое давление раствора растворитель вытекает ч/з мембрану.

Ультрафильтрация- разделение веществ с помощью мембранных фильтров. Простота, относительной экономичность и щадящее обращениес продуктом, осуществляется при умеренно низком внешнем давлении, не требуется изменения рН, ионной силы раствора или перевода продукта в другую фазу.

Метод выпаривания . Недостаток: для удаления растворителя концентрируемый раствор следует нагревать. . Нагревающим агентом может служить водяной пар.

Обезвоживание продукта (сушка)

1)обезвоживание в газообразных нагревающих агентах (пар, воздух, углекислый газ, дымовые газы и т. д.), которые с высокой скоростью подаются в сушильный аппарат снизу, а частицы обезвоживаемого продукта парят в этом газовом потоке. Преимущество: возможность регулировать интенсивность массо-теплообмена за счет изменения продолжительности пребывания препарата в воздушном потоке, а также возможность организации непрерывного процесса. Недостаток: прилипание продукта к стенкам сушильной камеры.

2)барабанные сушилки- подогреваемые барабаны вращаются в сосудах с микробной взвесью. Соприкасаясь со стенками барабана, взвесь обезвоживается и биомасса присыхает к поверхности барабана. Засохшую биомассу удаляют специальными ножами.

3)вакуумные сушильные шкафы при пониженных давлениях и температурах. 4)распылительные сушильные аппараты, в которых обезвоживающиеся растворы или суспензии превращаются путем пропускания через форсунки (или вращающиеся диски) в аэрозоль, который подается в сушильную камеру с нагретым газом (до примерно 110-150 °С). Выжив-ть бакт-х культур лишь 20-30 %, что не удовл-т требуем. качеству препаратов.

5)лиофильные сушки, особенно для высушивания лабильных белковых препаратов или препаратов медицинского назначения. Препараты предварительно замораживаются, и вода испаряется из замороженного состояния при высоком вакууме.

Модификация продуктов- необходимый этап при получении многих ферментов, гормонов и препаратов медицинского назначения. Например, у бычьего инсулина удаляются аминокислотные остатки, после чего он становится идентичным человеческому гормону.

Стабилизация продукта - добавлением к препаратам глицерина или углеводов, которые формируют многочисленные водородные связи с аминокислотными остатками, препятствуя тем самым их денатурированию при нагревании или спонтанной инактивации.