Выделение сапонинов

Выделение сапонинов из растительного сырья идет по общей схеме выделения природных соединений и состоит из следующих этапов:

1. Получение экстракта с использованием в качестве растворите­лей метилового, этилового спиртов и воды. Сырье предварительно об­рабатывают петролейным эфиром или четыреххлористым углеродом для разрушения комплексов сапонинов со стеринами, которые нерас­творимы в спиртах.

2. Упаривание, очистка и выделение из полученного экстракта сапонинов с использованием колоночной хроматографии на оксиде алюминия, силикагеле и др. сорбентах.

Ряд методов основан на способности сапонинов образовывать не­ растворимые в воде или водном растворе спиртов соли с гидроксидом бария, ацетатом свинца и.. * комплексы с холестерином, белками. По­ лученные соли или комплекс... -яют и разрушают с помощью специальных реактивов и получаюч .юлее чистые суммы сапонинов, которые подвергают дальнейшему разделению на индивидуальные компоненты.

Качественное обнаружение

Для качественных реакций на сапонины готовят водное извлече­ние из PC 1:10, нагревая его на водяной бане в течение 10 мин. Охла­ждают, фильтруют и с фильтратом проводят качественные реакции.

При обнаружении сапонинов в PC используют реакции трех типов:

1. Реакции, основанные на физических свойствах сапонинов.

2. Реакции, основанные на химических свойствах сапонинов.

3. Реакции, основанные на биологических свойствах сапонинов. К первой группе относится реакция пенообразования. Это не

только чувствительная, но и довольно характерная проба, т.к. других веществ, обладающих такой способностью к пенообразованию, в рас­тениях не встречается. Для ее выполнения берут две пробирки, в одну приливают определенный объем 0,1 н. NaOH (pH=13), в другую 0,1 н. раствор НС1 (рН=1). В обе пробирки добавляют по 3-4 капли извлече-

ния или раствора сапонина и сильно встряхивают. Если в сырье со­держатся тритерпеновые сапонины, то в обеих пробирках образуется пена, равная по объему и стойкости. При наличии сапонинов стероид­ной группы в щелочной среде образуется пена, в несколько раз боль­ше по объему и стойкости.

Ко второй группе обнаружения сапонинов в PC относятся реак­ции осаждения сапонинов и цветные реакции. Из водных растворов сапонины осаждаются гидроксидом бария и магния, солями меди, ацетатом свинца (тритерпеновые сапонины осаждаются средним аце­татом свинца, стероидные - основным). Из спиртовых извлечений (или растворов) стероидные и тритерпеновые сапонины выпадают в осадок при добавлении спиртового раствора холестерина в виде холе-стеридов.

К 2 мл водного извлечения прибавляют 1 мл 10% раствора нитра­та натрия и 1 каплю концентрированной серной кислоты. Появляется кроваво-красное окрашивание.

К 2 мл водного извлечения прибавляют 1 мл концентрированной серной кислоты, 1 мл этилового спирта и 1 каплю 10% раствора сер­нокислого железа. При нагревании появляется сине-зеленое окраши­вание (реакция Лафона).

Стероидные сапонины, как и сердечные гликозиды, дают реак­цию Либермана-Бурхардта с образованием розового окрашивания, пе­реходящего в зелено-синее.

К третьей группе реакций на сапонины относится реакция гемо­лиза эритроцитов крови за счет образования комплексов с холестери-ном мембран эритроцитов, вследствие чего оболочка эритроцита из полупроницаемой становится проницаемой, и гемоглобин выходит в плазму крови, окрашивая ее в красный цвет.

К 1 мл извлечения на изотоническом растворе добавляют 1 мл 2% взвеси эритроцитов в изотоническом растворе. Кровь становится про­зрачной, ярко-красной (гемолиз). Ввиду того, что различные сапони­ны при одинаковой концентрации имеют разный гемолитический ин­декс (механизм гемолиза также различен), каждое сырье должно иметь свой стандарт - раствор чистого сапонина.

Для обнаружения сапонинов в растениях методом хроматографии используют спиртовые извлечения из сырья, которые хроматографи-руют в условиях, указанных в нормативной документации и после вы­сушивания обрабатывают соответствующими реактивами. При опре­делении стероидных сапонинов хроматограмму опрыскивают реактивом Санье (5% спиртовым раствором ванилина) и 10 мин на­гревают в сушильном шкафу при температуре 110°С, затем опрыски­вают 50% раствором серной кислоты и снова высушивают. При нали­чии стероидных гликозидов появляются пятна желтого цвета.

При определении тритерпеновых сапонинов (в случае аралози-дов) хроматограмму опрыскивают 20% раствором серной кислоты, за­тем нагревают в сушильном шкафу при температуре 110°С в течение 10 мин. Аралозиды проявляются в виде пятен вишневого цвета.

Количественное определение

Единого метода количественного определения сапонинов в сырье нет. Использовавшиеся гравиметрические методы и методы, основан­ные на физических и биологических свойствах сапонинов, малоспе­цифичны и не точны.

В настоящее время чаще используют физико-химические методы. Они основаны на сочетании хроматографического разделения сапо­нинов с последующим количественным определением их. Для этой цели используют чаще спектрофотометрические методы.

Суммарная фракция сапонинов, производных тритерпеновых ки­слот, может быть определена титриметрическими методами. Исполь­зуются методы потенциометрического титрования (корни аралии ман­чжурской), титрования в неводных средах. Диосгенин в корневищах с корнями диоскореи дельтовидной определяют методом газовой хро­матографии.

Стероидные сапонины на ТСХ дают розовые пятна при проявле­нии парами ортофосфорной кислоты и интенсивно флуоресцируют в УФ-свете. Количество вещества определяют по флуоресценции с по­мощью флуориметра.