Хід роботи

виготовлення мазка. Мазки готують на чистих знежирених предметних скельцях. Перед приготуванням мазка предметне скло необхідно провести декілька раз через полум’я спиртівки.

мазки з культур мікробів. Предметне скло кладуть на стіл біля запаленої спиртівки. Пробірку з культурою беруть в ліву руку і утримують в наклонному положенні великим, вказівним і середнім пальцями. Матеріал з культури беруть прокаленою над полум’ям бакпетлею або стерильною пастерівською піпеткою. Тонкий кінець піпетки після прокалювання над полум’ям згинають під прямим кутом. Петлю або піпетку тримають в правій руці, цією ж рукою над полум’ям спиртівки відкривають пробірку, виймаючи ватну пробку і тримаючи її між мізинцем і долонею. Відкритий кінець пробірки обпалюють на полум’ї, петлю припалюють ще раз і вводять в пробірку, не дотикаючись її країв. Остудженою петлею захоплюють краплю культури. Потім закривають пробірку над вогнем пробкою з вати, також проведеної через полум’я горілки. Взятий матеріал наносять на предметне скло і розмазують тонким шаром, а петлю прокалюють і ставлять в штатив. Мазок розміщують в центрі скла.

мазки-відбитки з органів. Ділянку органа звідки будуть робить відбитки, припалюють шпателем або обпалюють на полум’ї. Стерильними ножицями вирізають невеликий кусочок досліджуваного органу і, захопивши його пінцетом, прижимають поверхнею розрізу до предметного скла, роблячи таким чином декілька відбитків. Кожний мазок з іншого боку скла обводять олівцем по склу і підписують.

висушування мазка. Приготовлені мазки висушують на повітрі. Для прискорення сушки можна обережно підігріти на полум’ї горілки.

фіксація мазка. Після висушування мазки фіксують фізичним або хімічним способами. Фізична фіксація – це проведення мазка над полум’ям горілки (3-4 рази). Хімічна фіксація – спирт-ректифікат 15-20 хвилин, суміш спирта з ефіром (пополам) 10-15 хвилин, метиловий спирт – 5 хвилин, хлороформ – декілька секунд.

ПИГОТУВАННЯ РЕАКТИВІВ:

а) карболовий генціанвіолет – 1г кристалічного генціанвіолету розтирають у ступці з 2г кристалічної карболової кислоти(фенол). Під час розтирання невеликими порціями прибавляють 10мл 96% етилового спирту. Розчиняють фарбу і додають 100мл дистильованої води, фільтрують через паперовий фільтр. б) люголівський розчин – 2 грама йодистого калію розчиняють в 25 мл дистильованої води, потім добавляють 1 грам кристалічного йоду витримують 5-6 годин і доливають до 300 мл дистильованою водою;

в)фуксин карболовий (Ціля) – 1 грам основного фуксину розтирають в ступці з 5 грамами кристалічної карболової кислоти і декількома краплями гліцерину. Добавляють 10 мл спирту-ректифікату і 100 мл дистильованої води. Розчин фільтрують

г)насичений спиртовий розчин метиленового блакитного – 100 мл 96% етилового спирту розчиняють 8-9 г метиленового блакитного. Розчин фільтрують.

Для приготування водно-спиртового розчину метиленового блакитного до 30 мл дистильованої води додають 1 мл насиченого спиртового розчину метиленового блакитного.

д)метиленово блакитний за Леффлером – 100 мл дистильованої води , додають 30 мл насиченого спиртового розчину метиленового блакитного та 1 мл 1% розчину гідрату окису калію.

методика фарбування.(за грамом) .

На фіксований мазок кладуть фільтрувальний папір і на нього наливають розчин генціанвіолету. Через 2 хвилини папір викидають, фарбу зливають і на препарат наливають люголівський розчин. Через 1 хвилину люголівський розчин зливають і препарат на протязі 30 секунд обробляють спиртом-ректифікатом. Потім препарат промивають водою і додатково фарбують спирто-водним фуксином на протязі 2 хвилин. Після цього препарат промивають водою, висушують і роздивляються під мікроскопом.

мікрокартина: грампозитивні мікроби забарвлюються в темно-фіолетовий колір, грамнегативні – в рожевий колір.

МЕТОДИ ФАРБУВАННЯ КАПСУЛ (за Міхіним) .

На фіксований препарат наливають 1 % розчин метиленового блакитного з легким підігріванням на протязі 6 хв до появи пари. Злегка промивають водою¸ швидко висушують і мікроскопують .Капсула – рожева¸ мікробна клітина – темно – червона.

МЕТОДИ ФАРБУВАННЯ СПОР (методом Пєшкова)

На виготовлений і зафіксований мазок наливають синьку Леффлера¸ підігрівають до появи пари і кип’ятять протягом 15 – 20 сек. Після випаровування фарби препарат охолоджують¸ промивають і дофарбовують 30 сек 0¸5 % розчином нейтральроту. Спори фарбуються в синій колір ¸ а цитоплазма – в червоний.

перед роботою з мікроскопом необхідно провірити взаємодію всіх його частин, справність їх і встановити освітлення. Для цього револьвер переводять на об’єктив найменшого збільшення і спостерігаючи в окуляр, дзеркалом ловлять джерело світла, добиваючись максимального освітлення. При денному світлі користуються, як правило, плоским дзеркалом, при штучному – ввігнутим. В ролі джерел штучного світла застосовують лампи-освітлювачі. Коли світло встановлене, беруть препарат, поміщають його на предметний столик, закріплюють зажимачами і вивчають спочатку під малим, потім великим збільшенням, використовуючи для цього суху і імерсійну системи.

підготовка і стерилізація предметних скелець. Миття лабораторного посуду має велике значення. Погано вимитий посуд може бути причиною неправильного результату лабораторних досліджень і невдач при культивуванні мікроорганізмів.

Бувші у використанні предметні скельця вміщують на 2 години в сірчану кислоту після чого кип’ятять в 2 % лугу – 15 хв.¸ а потім добре промивають водою. Вимиті скельця ополіскують дистильованою водою і висушують на дошці, або в сушильній шафі..

Нові скельця кип’ятять в 1-2 %-ному розчині соди -15 – 20 хв¸ потім промивають водою. Підготовлені скельця зберігаються у склянках з притертими пробками пополам - 96 спирті та ефірі.

ПІСЛЯ ВИКОНАННЯ РОБОТИ СТУДЕНТИ ПОВИННІ

ЗНАТИ

Техніку виготовлення фарбуючи розчинів, техніку виготовлення мазків-відбитків ¸ мазків із культур¸ будову мікроскопа і правила роботи з ним, правила безпеки і особистої гігієни при роботі з інфікованим матеріалом, правила стерилізації предметних скелець.

ВМІТИ

Виготовляти фарбуючі розчини, виготовляти мазки-відбитки і пофарбувати їх; користуватися мікроскопом, досліджувати мазки під різним збільшенням, знезаражувати предметні скельця.

ЗАВДАННЯ ДОДОМУ(самостійна робота) Оформити роботу. Вивчити будову мікроскопа¸ замалювати його в зошит. Замалювати мікрокартину.

Вивчити правила безпеки і особистої гігієни при роботі з заразним матеріалом.

Питання для самоконтролю :

1. Як виготовляють мазки ?

2. Як фарбують мазки за Грамом ?

3. Які правила безпеки і особистої гігієни при роботі з заразним матеріалом?

4. Яка будова мікроскопу ?

5. Яка техніка мікроскопування ?

6. Які основні форми мікробів ?

Інструктивна карта

для проведення навчальної практики № 2

з дисципліни “Епізоотологія з мікробіологією”

ТЕМА: Виготовлення простих живильних середовищ. Техніка посіву на живильні середовища.

РОБОЧЕ МІСЦЕ: Лабораторія епізоотології з мікробіологією.

ТРИВАЛІСТЬ ЗАНЯТТЯ: 9 годин в т.ч.3 години самостійна робота.

МЕТА: Набути навичок виготовлення простих живильних середовищ та посіву і вирощування культур мікробів.

ПРЕПАРАТИ ТА ПРИЛАДИ: автоклав, термостат, бактеріологічні чашки і пробірки, газова плита, водяна баня, спиртівки, бакпетлі, пастерівські піпетки, олівці для писання по склу, пінцети, стерильні поживні середовища (м’ясна вода, МПБ, МПА), нестерильна м’ясна вода, пептон, агар-агар, желатин.

ПРАВИЛА ОХОРОНИ ПРАЦІ І ОСОБИСТОЇ ГІГІЄНИ: Дотриматися правил техніки безпеки роботи в лабораторії і засобів особистої гігієни.

КОРОТКІ ВІДОМОСТІ З ТЕОРЕТИЧНОЇ ЧАСТИНИ РОБОТИ.

Для вирощення мікробних культур використовують живильні середовища. Живильні середовища бувають простими (МПБ, МПЖ і МПА), спеціальні (сироватковий агар і бульйон, кров’яні середовища), і диференціально-діагностичні (середовища з вуглеводами, середовище Ендо, та інші). Середовища на яких добре ростуть деякі види бактерій і не ростуть або погано ростуть інші види, називають елективними.

ПОРЯДОК ВИКОНАННЯ РОБОТИ:

1. Виготовити живильні середовища для вирощування мікробів і м’ясо-пептонний бульйон (МПБ), м’ясо-пептонний агар (МПА), середовище Ендо.

2.Скласти конспект схему виготовлення простих живильних середовищ (МПА¸МПБ¸МПЖ).(самостійна робота).

3. Замалювати ріст мікробних культур на живильних середовищах. (самостійна робота).

ЛІТЕРАТУРА :

1. Н. Асонов Практикум. ст..46-62.

2. М. Горбань Практикум. ст..27-33.

3. Інструктивна картка навчальної практики №2.

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ. При роботі з живильними середовищами, лабораторним посудом дотримуватись правил роботи в лабораторії і особистої гігієни. Всі студенти повинні працювати в халатах, косинках. Готувати живильні середовища необхідно обережно, правильно, згідно настанови. Розділитися по групах 4 чоловіки і виконувати роботу.

ХІД РОБОТИ

Основні живильні середовища: щоб мікроби росли, розмножувалися, виявляли собою життєздатність потрібні певні живильні середовища. Живильні середовища бувають рідкі і тверді. Будь-яке живильне середовище повинно відповідати таким вимогам: містити в собі достатню кількість поживних речовин, мати певну реакцію середовища, яка є оптимальною для того чи іншого мікроба, бути абсолютно стерильним з тим, щоб можна було використати чисту культуру досліджувальних мікробів. Живильні середовища готують із продуктів тваринного і рослинного походження мікробів (картоплі, моркви, крові, м’яса, сироватки, молока, яєць).

Живильні середовища поділяють: прості або звичайні, спеціальні (вибіркові) і диференціально-діагностичні.

прості або звичайні живильні середовища. До них належать м’ясопептонний агар, м’ясопептонний бульйон. На цих середовищах вирощують більшість хвороботворних і сапрофітних мікробів, бацили сибірки, кишкову паличку та інше.

спеціальні живильні середовища. На них вирощують мікроби, які не ростуть на простих середовищах. На кров’яному агарі вирощують стрептококові та інші. Сюди входять і синтетичні середовища. Для культивування туберкульозних мікобактерій застосовують середовища Левінштейна-Йєнсена, Гельберга, Петраньяні.

диференціально-діагностичні: ці середовища застосовують для виявлення різних ферментів, які визначають ферментні властивості мікробів.

ВИГОТОВЛЕННЯ ПРОСТИХ ЖИВИЛЬНИХ СЕРЕДОВИЩ. Прості живильні середовища МПА і МПБ готують на м’ясній воді. М’ясна вода – м’ясо звільняється від кісток, жиру, сполучної тканини, пропускається через м’ясорубку, заливають водою у співвідношенні на одну валову одиницю м’яса 4 вагомих одиниць і кип’ятять одну годину. Рідину фільтрують через вату або марлю, потім через фільтрувальний папір фільтрат вимірюють і доливають до початкового об’єму дистильованою водою.

Другий спосіб. М’ясний фарш заливають водою у співвідношенні 1:2 або 1:4, ретельно перемішують і залишають на одну добу в прохолодному місці. На другий день фарш віджимають, настій кип’ятять 30 хвилин і фільтрують. Виготовлену м’ясну воду розливають в бутлі і стерилізують 30-40 хвилин в автоклаві при тискові в 1-ну атм.

М’ЯСОпептонний бульйон (МПб). До м’ясної води добавляють 1% пептону, 0,5% хімічно-чистої вивареної солі і кип’ятять до розчинення пептону. Потім визначають реакцію середовища з додаванням 10% розчину питної соди або децинормального розчину їдкого натрію, визначають рН 7,2-7,4. Після цього бульйон розливають і ще раз кип’ятять 15-20 хвилин і фільтрують через паперовий фільтр. Готовий бульйон розливають у пробірки, колби, стерилізують 15-20 хвилин в автоклаві при тискові в 1-ну атм.

М’ЯСО-пептонний агар (МПА). В м’ясо-пептонний бульйон доливають 2-3% агар-агару і розчиняють його нагріванням у автоклаві або апараті Коха. Потім визначають рН і доводять до 7,2-7,4 додаючи 10% їдкої двовуглекислої соди (питної соди) або децинормального розчину їдкого натру. Для прояснення середовища на 1 л розплавленого і охолодженого 50ºС агару добавляють білок одного курячого яйця або 10 мл кров’яної сироватки, після чого нагрівають 20 хвилин у автоклаві при температурі 105ºС для звертання білка. Фільтрують у гарячому вигляді через ватно-марлевий фільтр, розливають в колби і пробірки, стерилізують в автоклаві при тискові в 1 атм. протягом 20-30 хвилин.

Сухі живильні середовища. Зараз в лабораторній практиці широко використовують готові сухі живильні середовища, які випускає промисловість. Їх розчиняють в дистильованій воді, розливають у колби або пробірки чи бактеріологічні чашки, а при необхідності стерилізують.

техніка посіву мікробів на живильні середовища.

посів у чашки Петрі. Піднявши край чашки, проводять посів петлею або шпателем і закривають чашку. Позначають і розміщують її у термостаті догори дном, щоб крапельки води, які утворюються з пари на кришці чашки, не потрапили на поверхню середовища і не розмивали ізольовані колонії.

Посів на косий агар у пробірках. Лівою рукою горизонтально тримають пробірку з середовищем. Правою рукою беруть петлю, обпалюють її на полум’ї спиртівки, охолоджують і вводять у посудину з досліджуваним матеріалом. Виймають пробку з пробірки, обпалюють отвір пробірки на спиртівці, вводять петлю в пробірку і зигзагоподібними рухами розсівають по поверхні косого агару. Виймають петлю, знову обпалюють край пробірки (і пробку), закривають пробірку і ставлять у термостат.

Посів уколом у стовпчик МПА застосовують для вирощування анаеробів, для виявлення характерних ознак бактерій або з метою тривалого зберігання культур.

Отже, у дослідження по виділенню чистих культур різних організмів (бактерій тощо) входять такі основні операції: 1) посів досліджуваного матеріалу; 2) виділення чистої культури; 3) ідентифікація цієї культури.

техніка пересіву мікробів. в ліву руку беруть дві пробірки, тримаючи їх великим, вказівним і середнім пальцями в нахиленому положенні. Пересів роблять за допомогою бакпетлі яку прокалюють над полум’ям. Пастерівську піпетку проводять через полум’я, вгинають капіляр і обламують його перед посівом. Над полум’ям горілки правою рукою відкривають дві пробірки тримаючи ватні пробки між мізинцем і долонею правої руки. Краї пробірок обпалюють над полум’ям, бакпетлею захоплюють невелику кількість матеріалу і швидко переносять у пробірку з свіжим середовищем.

Після того, як зробили пересів обпалюють краї пробірок на полум’ї. Закривають їх пробками, проведеними через полум’я. Бакпетлю прокалюють над полум’ям і ставлять в штатив, пастерівську піпетку – в дезрозчин. Пробірку з середовищем підписують.

виділення чистих культур. Для виділення чистих культур застосовують метод дробного посіву мікробної суспензії на поверхні твердих живильних середовищ.

Готовий агар (МПА) у колбах розтоплюють на водяній бані і розливають в бакчашки, потім чашки в переверненому стані ставлять на добу в термостат для перевірки на стерильність. Пробірку з мікробною суспензією беруть в ліву руку і тримають в нахиленому стані. Відкривши пробірку бакпетлею захоплюють невелику кількість посівного матеріалу, розтирають його по поверхні живильного середовища. Петлю прокалюють і ставлять в штатив, піпетку – в дезрозчин.

методи культивування мікробів. Для вирощування мікробів необхідна температура 36-37ºС. Для цього засіяні живильні середовища поміщають в термостат. Посіви втримують в термостаті на протязі кількох діб. За ними спостерігають, а після появлення росту вивчають отримані культури.

ПІСЛЯ ВИКОНАННЯ РОБОТИ СТУДЕНТИ ПОВИННІ:

ЗНАТИ:

1. Що таке живильні середовища?

2. Які бувають живильні середовища?

3. Як виготовляються прості живильні середовища?

4. Що собою представляють сухі живильні середовища?

5. Як проводиться посів на живильні середовища?

ВМІТИ:

1. Виготовити прості живильні середовища.

2. Провести посів на прості живильні середовища.

ЗАВДАННЯ ДОДОМУ: (самостійна робота)

Оформити роботу. Скласти схему виготовлення простих живильних середовищ.(МПБ¸ МПА ).Замалювати ріст мікробних культур на живильних середовищах.

Питання для самоконтролю :

1. Що таке живильне середовище ?

2. Які бувають живильні середовища ?

3. Як виготовляються прості живильні середовища ?

4. Що таке сухі живильні середовища ?

5. Як проводять посів на живильні середовища?

6. Як ростуть мікроби на живильних середовищах ?